Вес мксм 800: управление, двигатель, габаритные размеры, рабочее оборудование

Содержание

Каталог продукции

Мини-погрузчик МКСМ-800H (многоцелевая коммунально-строительная машина) служит для погрузочных и транспортировочных работ с грунтом и сыпучими породами, планирования территории, снегоочистки и мусороуборки, рытья ям и траншей, скважного бурения.

Наиболее часто МКСМ-800H применяется при промышленных, строительных, коммунальных и дорожных работах, а также в других отраслях, где тесные условия не позволяют использовать крупногабаритную технику.

Высокая степень компактности и отличная управляемость позволяют использовать МКСМ-800H в стесненных условиях. Габаритные размеры машины дают возможность проникать в проемы высотой от 2,1 м и шириной от 1,8 м. МКСМ-800H наиболее эффективно проявляет себя при уходе за тротуарами, дорожками для пешеходов, аллеями, рынками, проведении ландшафных и дорожных работ. Небольшой вес и габаритные размеры погрузчика МКСМ-800H позволяют осуществлять его транспортировку в грузовом автомобиле или прицепе.

Основным преимуществом МКСМ-800H является универсальность машины, обеспечиваемая разнообразным быстросменным навесным оборудованием. Смена навесного оборудования настолько легка, что ее может провести сам оператор, при этом гидросистемы машины и навесного оборудования без слива рабочей жидкости соединяются посредством быстросъемной муфты.

МКСМ-800 плавно меняет скорость движения и разворачивается на месте благодаря бесступенчатому переключению скоростей в правой и левой коробках передачи при помощи объемного гидропривода. Управление движением осуществляется двумя джойстиками, установленными в боковых панелях.

Преимущества погрузчика МКСМ-800H

перед аналогами:

  • небольшие габаритные размеры, высокая управляемость и проходимость;
  • широкая линейка навесного оборудования для проведения различных работ;
  • управление машиной и навесным оборудованием осуществляется при помощи джойстиков;
  • экономичный дизельный двигатель с жидкостным или воздушным охлажденикм;
  • объемный гидропривод, обеспечивающий плавное изменение скорости вращения бортовых редукторов;
  • имеется возможность использования гидравлического оборудования;
  • электрическое или механическое управление;
  • простота обслуживания и ремонта.

Мини погрузчики МКСМ-800H выпускаются в двух модификациях, различающихся моделями устанавливаемых дизельных двигателей: МКСМ-800К оснащается дизельным двигателем A2300 производства американской фирмы Cummins, МКСМ-800Н — немецким двигателем Hatz 3M41.

Новая серия МКСМ-800А

Осенью 2011 года прошла испытания новая модернизация мини погрузчика МКСМ, получившая наименование МКСМ-800А. Отличительными особенностями погрузчиков из новой серии являются сварная рама, включающая цепные редукторы и баки, убран шестереночный привод насоса (гидронасос установлен прямо на корпус сцепления), а вместо исключенной штанги с рычагами применен клапан выравнивания. Применены импортные цепные редукторы вместе с двумя скоростными гидромоторами. Для обеспечения лучшего запуска мини погрузчика при низких температурах между двигателем американского производства Cummins и гидронасосами устанавливается муфта сцепления.

МКСМ-800H

Мини-погрузчик МКСМ-800Н

Наименование (модель)

МКСМ-800Н

Двигатель

Дизельный HATZ 3M41

Тип двигателя

  Четырехтактный трехцилиндровый, с воздушным охлаждением 

Расположение цилиндров

рядное

Соответствие Европейскому экологическому стандарту

ЕЭК ООН №24-03

Ресурс двигателя до первого капремонта, моточасов

не менее 18000

Номинальная частота вращения коленвала двигателя, об/мин

2300

Удельный расход топлива при вышеуказанной мощности, г/кВт*ч (г/л. с*ч)

220 (161,8)

Среднечасовой расход топлива, л/ч

6

Минимальная частота вращения коленвала двиг. На холостом ходу, об/мин

850 (+50)

Возможность использования мини погрузчика в закрытых помещениях по показателю дымности, в соответствии с европейским стандартом

наличие

Мощность двигателя, кВт (л.с.), не менее

36,8 (50)

Расход масла после обкатки

1% от расхода топлива при полной нагрузке

Номинальная частота вращения коленчатого вала, об/мин

2300

Номинальная частота вращения коленчатого вала на холостом ходу, об/мин

850

Рабочее давление двигателя, Мпа (кг/см²)

16(160)

Максимальная грузоподъемность, кг не менее

800

Максимальная грузоподъемность, Н (кгс), не более

8000

Максимальная статическая опрокидывающая нагрузка, Н

16000

Эксплуатационная масса с основным ковшом, кг

2800 ± 2,5 %

Транспортная масса с основным ковшом, кг

2655 ± 2,5 %

Полная масса машины, кг

3700 ± 2,5 %

Максимальная сила тяги, кН

24

Максимальная скорость движения, км/ч не менее

10

Минимальный радиус поворота с основным ковшом, мм

2440

Уровень звука на рабочем месте, дБА, не более

92

Корректированное по частоте значение виброускорения  (вертикального) на рабочем месте, дБ, не более

115

Корректированное по частоте значение виброускорения  (вертикального) на органах управления, дБ, не более

126

Основные размеры

 

ширина машины, мм, не более

1680

длина машины с основным ковшом, мм, не более

3270

длина машины без ковша, мм, не более

2480

высота машины по крыше кабины, мм, не более

2065

высота по вентилятору системы вентиляции, мм, не более

2220

высота машины по проблесковому фонарю, мм, не более

2225

база, мм

1020

ширина колеи, мм, не более

1410

максимальный вылет ковша, мм

1370

Вылет ковша при разгрузке (при максимальном угле разгрузки), мм 

640

ширина основного ковша, мм

1730

максимальная высота погрузчика с поднятым ковшом, мм

3700

максимальная высота передней кромки ковша при    максимальном угле разгрузи 37º, мм

2410

высота передней кромки ковша при максимальном  вылете, мм

1485

дорожный просвет, мм, не менее

206

максимальная высота точки подвески ковша, мм

3060

передний угол свеса машины

16°

задний угол свеса машины

23°

угол перехода

124°

угол опрокидывания ковша на себя

39°

угол врезания ковша в верхнем положении

45°

угол опрокидывания ковша от себя в верхнем положении

37°

поперечный угол просвета

138°

Преодолеваемые препятствия

 

Работа на уклоне, град. , не более

Удержание стояночным тормозом на уклоне, не более

13°

предельное значение переднего угла проходимости, не менее

13º

предельное значение заднего угла проходимости, град. не менее

23º

Кабина

цельнометаллическая,   опрокидываемая вперед (для доступа к узлам и агрегатам для обслуживания и ремонта)

Крепление кабины к раме

шарнирное

Операторское кресло

подрессорено, имеет возможность продольного перемещения

Ремень безопасности двух точечный

в наличии

Дуга безопасности

в наличии

Расположение всех приборов и управления

в кабине оператора

Отопление, вентиляция, шумоизоляция кабины

в наличии

Кабина стальная с круговым остеклением

в наличии

Внутреннее освещение кабины

в наличии

Электрический звуковой сигнал

в наличии

Наружные зеркала заднего вида

в наличии

Стеклоочиститель

Пер. стекла — электрический

Заднего стекла-с ручным приводом

Уровень звука на рабочем месте, дБа

92

Трансмиссия

Гидрообъёмная передача (ГОП) с шестеренчатыми коробками передач

Максимальная сила тяги, кН

24

Колёсная формула

4×4

Скорость передвижения назад и вперёд, км/ч не менее

10

Гидравлические преобразователи

 

Гидронасос

аксиально-плунжерный регулируемый, 2 шт.

Коробка передач

шестеренчатый редуктор, с дисковым тормозом — 2 шт.

Способ управления движением машины, поворотом и рабочим тормозом

Бесступенчатое регулирование скоростей правой и левой коробки передач с помощью рычага управления (джойстик)

Привод насосов

Шестеренчатый редуктор с однодисковой фрикционной муфтой

Тип привода

Механический

Гидравлическая система рабочего оборудования

 

насос

шестеренчатый

раб давление МПА (кгс/кв. см), не менее

16 (160)

Колеса

 

Шина

10,0/75-15,3

Размер ободов

9,0-15,3

Пригодны для работы на грунтах с низкой несущей способностью

Давление в шинах, кПа (кгс/кв. см)

240 +/-25   (2,4+/-0,25)

Аккумуляторная батарея

 

Напряжение электрооборудования, В

12

Номинальное напряжение, В

12

Емкость, А*ч

90

Количество, шт.

1

Проблесковый фонарь

в наличии, 1 шт.

Звуковой сигнальный прибор

в наличии, 2 шт.

Автономный воздушный отопитель

в наличии, 12 В

Заземлен

минус

Мини-погрузчик МКСМ-800Н

Параметры

Значение

Наименование

Минипогрузчик с бортовым поворотом


МКСМ-800Н

Максимальная грузоподъемность, кг

800

Объем ковша, м3

0,46

Ширина ковша, мм

1730

Масса ковша, кг

150

Максимальная статическая опрокидывающая нагрузка, кг

1600

Эксплуатационная масса с основным ковшом, кг

2800

Транспортная масса с основным ковшом, кг

2655

Полная масса машины, кг

3700

Двигатель

HATZ 3M41 (Германия)

Тип двигателя

дизельный, трёхцилиндровый, четырехтактный

Система охлаждения

воздушная

Количество цилиндров

3

Рабочий объем двигателя, куб.

см

2574

Максимальная частота вращения коленчатого вала, об.мин

2500

Эксплуатационная мощность, кВт/л.с.

36,8 /50

Макс. крутящий момент, Нм

163

Диаметр цилиндра,  мм

102

Ход поршня, мм

105

Ёмкость картера, л

8,5

Степень сжатия

18,7 : 1

Предпусковой подогреватель

автоматический

Размеры (ДхШхВ), мм

753 х 570 х 733

Вес двигателя, кг

255

Максимальная сила тяги, кН

24

Максимальная скорость движения, не менее км/ч

10

Минимальный радиус поворота с основным ковшом, мм

2440

Уровень звука на рабочем месте, дБ, не более

92

Топливный бак, л

55

Удельный расход топлива, г/кВт ч (г/л.

с ч)

220 (161,8)

Преодолеваемые препятствия

Работа на уклоне, не более

Удержание стояночным тормозом на уклоне, не более

13°

Угол подъема, не более

13°

Навесное оборудование

ковши, щетка, отвал, вилы, снегоочиститель,экскаватор, рыхлитель, бетоносмеситель, фреза

Гарантия

12 мес. или 1000 моточасов наработки

Производитель

ПАО «Курганский машиностроительный завод», Россия

Вилы грузовые

Грузовые вилы – мощное подъемное навесное оборудование с шириной захвата от 220 до 1550 мм. Этот инструмент можно назвать основным рабочим приспособлением для погрузчиков, поскольку на него ложится большинство производимых операций. Широко эксплуатируются в складских хозяйствах открытого и закрытого типа, на торговых и промышленных предприятиях, в транспортных терминалах и сельскохозяйственных комплексах.

Предназначены для погрузочно-разгрузочных операций, транспортировки и складирования штабелируемых материалов, грузов, ящиков, поддонов. С помощью вил  грузы можно перемещать как на открытых складах, так и в терминалах. Вилы состоят из рамы и двух лап (навесов). Навесы могут быть установлены на ширину 230 мм, 560 мм, 1230 мм и 1550 мм с помощью пластин, приваренных к раме, и фиксируются с помощью штырей.

Ассортимент МКСМ (Многоцелевая коммунально-строительная машина) представлен модельным рядом 800А, 800, 800Н, 1000Н. Компания MKSM-Сервис предлагает новые и поддержанные фронтальные погрузчики, мини-погрузчики, МКСМ. На нашей автобазе представлена техника производителей Курганмашзавод, Четра, LiuGong. Здесь можете найти двигатели для техники Zetor, Cummins, Hatz. Доп навесное оборудование представлено большим выбором. Это вилы с прижимом и грузовые, ковш основной и карьерный, снегоочиститель, отвал, щетки и т.д. К тому же предлагаем сервисное обслуживание и ремонт у вас или у нас в Мурино.

Целевым назначением грузовых вил на многофункциональной коммунально-строительной машине являются:

  • погрузочно-разгрузочные работы;
  • транспортировка и складирование штабелируемых грузов из различного материала, тарных ящиков, поддонов.

Грузовые вилы представляют собой конструкцию из рамы и двух лап. Навес устанавливается на необходимую ширину захвата посредством пластин, завальцованных с рамой. Крепится устройство с помощью штырей. Оборудование предназначено для работы с грузами до 800кг, которые можно поднимать на высоту 3м. Вес самой установки – 131 кг. Легкость и простота монтажа грузовых вил позволяет использовать их на всевозможных объектах в самых разных условиях эксплуатации.


База в Мурино располагает техническим оснащением для сервиса и ремонта техники. Для покупки фронтального погрузчика, MKSM, спец-техники или навесного оборудования звоните в МКСМ-Сервис в Петербурге. На базе много комплектующих и запчастей. Компания осуществляет диагностику и ремонт МКСМ и мини-погрузчиков. Диагностика и Выезд бесплатно! Эвакуация! Обслуживание на вашей площадке! Выездная служба располагает профессиональными ремонтниками, спецтранспортом и спецоборудованием и способна провести техническое обслуживание, а также средний и мелкий ремонт мини-погрузчиков, тракторов, погрузчиков, МКСМ с выездом к вам в г. Санкт-Петербурге и Лен. Области. Для детальной информации звоните по телефону в Петербурге +7(812) 309-03-80.

В компании МКСМ сервис купили несколько грузовых вил для многоцелевых коммунально-строительных машин. Техника работает на складе. Навесное покупали для перевозки и складирования контейнеров небольших, поддонов, ящиков. Заказывали прямо с сайта mksm-servis.ru. Оплатили, получили оборудование в срок. Нареканий к работе поставщика и качеству товара нет. Спасибо

Евгения

Мхм 800 масс. Технические характеристики, мкм. Съемное рабочее оборудование

Универсальная коммунальная строительная машина МКСМ является одним из лидеров продаж в своем сегменте, ведь технические характеристики, долговечность и производительность этих машин находятся на высоком уровне, а за многолетнее использование машин МКСМ пользователи смогли убедиться в надежности и долговечности данной модели.

Область применения многоцелевых коммунальных строительных машин МКСМ

Чрезвычайно широкий: от небольших участков до промышленных зон.Конструктивные особенности этих машин позволяют плавно изменять их скорость и направление движения, поворачиваться вокруг собственной оси. МКСМ наиболее востребованы в строительных организациях, на предприятиях жилищно-коммунального хозяйства, дорожного хозяйства, промышленности и транспортной отрасли. Популярность этой техники объясняется сочетанием ее универсальности, позволяющей механизировать практически все коммунальные, транспортные, строительные, погрузочные и землеройные работы, компактности и высокой маневренности, позволяющей организовать работу в стесненных условиях (в узких проходах, в закрытых помещениях, на дворовых территориях), где общие ограничения делают невозможным применение традиционных методов.

Габаритные размеры МКСМ позволяют проникать даже в проемы высотой 2,1м и шириной 1,8м. МКСМ идеально подходит для ухода за тротуарами, пешеходными дорожками, аллеями, рынками, инженерными коммуникациями, содержанием дорог и ландшафтным дизайном.

Кроме того, температурный диапазон эксплуатации МКСМ от -40 до +45, удовлетворяет потребности потребителей во всех климатических зонах России. Модели МКСМ оснащены современными дизельными двигателями, соответствующими нормам европейских экологических стандартов.Применительно ко всем модификациям МКСМ сохраняется основной принцип — обеспечение максимальной универсальности оборудования, т.е. применимости во всех основных сегментах рынка, в том числе за счет сохранения широкой номенклатуры быстросъемного навесного оборудования.

По заявкам потребителей на МКСМ поставляется комплект навесного оборудования: для погрузочного (различные ковши, вилы и другое оборудование), уборочного (щетки, отвал, снегоочиститель и др.), землеройного (буровая, землеройная техника), строительного (бетономешалка) и другие работы, в том числе на грунтах с низкой несущей способностью (в случае установки на МКСМ комплекта металлических гусениц, повышающих тягово-сцепные свойства машины).

При этом замена рабочего оборудования занимает мало времени – оборудование оснащено быстродействующим зажимом, что позволяет оператору самостоятельно и без применения дополнительных инструментов менять оборудование.

Характеристики МКСМ
МКСМ 800Н МКСМ 800К МКСМ 1000
Двигатель
Модель ХАТЗ 2М41 ХАТЗ 2М41 ХАТЗ 3М41 КАММИНС А2300 ХАТЗ 3М41
тип двигателя дизельный, четырехтактный
2-цилиндровый
дизель, четырехтактный 3-цилиндровый дизельный, четырехтактный дизельный, четырехтактный
3-цилиндровый
Система охлаждения антенна антенна вода антенна
Мощность номинальная, кВт (л. с.) 27 (36) 27 (36) 36,8 (50) 33 (44) 36,8 (50)
Удельный расход топлива, г/кВтч (г/л.с.з) 220 (161,8) 220 (161,8) 220 (161,8) 253 (186) 220 (161,8)
Топливный бак, л 50 50 50 50 50
Подогреватель авто авто авто
Технические характеристики
Максимальная грузоподъемность, кг 550 650 800 990
Максимальная скорость движения, км/ч 10 10 10 10
Преодолеваемая проходимость, град, не более 13 13 13
обогреватель автономный автономный зависимый автономный
Габаритные размеры, масса
Длина с основным ковшом, мм 3200 3200 3270 3270
Ширина машины с шинами, мм 1400 1400 1680 1680
Ширина колеи, не более, мм 1180 1180 1410 1410
Высота машины по проблесковой лампочке, мм 2200 2200 2215 2215
Дорожный просвет, не менее, мм 200 200 206 206
Эксплуатационная масса с основным ковшом, мм 2400 2400 2800 3400

Навесное оборудование для МКСМ для погрузочных работ

Основной ковш . Предназначен для погрузки и перемещения различных грузов — удобрений, сыпучих материалов (опилки, стружка), снега, различных видов грунта. Кроме того, ковш можно использовать как отвал для перемещения и выравнивания почвы.

Грузовая стрела . Он используется для подъема, перемещения, погрузки и транспортировки крупногабаритных грузов.

Грузовой штифт . Используется для перемещения, погрузки и транспортировки крупногабаритных грузов (бумажные рулоны, мотки проволоки, трубы).

Зажимные вилки . Используется в строительном сельском хозяйстве, при обустройстве садов, парков и других отраслях хозяйства.Их можно использовать при погрузке измельченных кустарников, спиленных стволов, веток, при работе с соломой, сеном, силосом, навозом, металлоломом, щебнем, трубами, вторсырьем и другими длинномерными грузами.

Грузовая вилка . Используется для перевозки, складирования и других грузовых операций, выполняемых со штабелируемыми товарами, ящиками, поддонами и другими материалами, которые можно штабелировать. Вилки используются в т.ч. на складах и таможенных терминалах.

Навесное оборудование МКСМ для общественных работ

Лезвие поворотное .Предназначены для перемещения (сгребания и распределения) различных материалов при планировке территории, для вывоза горных пород и различных сыпучих и штучных материалов с площадок, для обратной засыпки траншей, а также для расчистки дороги от мусора.

комбайн . Применяется на коммунальных работах при очистке производственных помещений, дворов, тротуаров, пешеходных дорожек и других территорий с твердым покрытием от мусора, а также для сбора пыли, песка, грязи.

Дорожная щетка . Применяется для уборки и подметания пешеходных дорожек, площадей, дорог, тротуаров, дворов и других территорий с твердым покрытием.

снегоочиститель . Предназначен для уборки свежевыпавшего и утрамбованного снега.

Распределитель антиобледенительных материалов . Предназначен для обработки дорог, улиц, площадей, аэродромов и других территорий специальными антигололедными материалами.

Оборудование для МКСМ для земельных работ

Траншейный экскаватор . Предназначен для рытья прямоугольных траншей в грунтах: легкой супесчаной, растительной почве, торфе, влажном песке, мелком гравии.

Многоковшовый экскаватор .Предназначен для рытья ям, канав, траншей в грунтах: легкой супесчаной, растительной земле, торфе, влажном песке, мелком гравии.

Рыхлитель . Предназначен для рыхления тяжелых плотных грунтов, в том числе: глины, суглинка, булыжника, мерзлого песка.

Буровое оборудование . Предназначен для бурения скважин диаметром 200, 300 и 400 мм в немерзлых грунтах 1-4 категории (глина, растительный грунт, торф, влажный песок, мелкий гравий).

Навесное оборудование для строительных работ

бетономешалка .Предназначен для приготовления подвижных бетонных смесей на различных строительных площадках с небольшим объемом работ при температуре окружающего воздуха не ниже 5°С

Погрузчик МКСМ-800 – достаточно популярная техника на российском рынке. Эта техника активно используется во всех сферах коммунального хозяйства и производства, в частности, погрузчики используются для разгрузки и погрузки сыпучих материалов, поддонов, отдельных грузов и прочего. По своему назначению МКСМ-800 является многоцелевой машиной, функциональные возможности которой различаются в зависимости от конкретного устанавливаемого навесного оборудования.Завод-производитель «Курганмашзавод» занимается разработкой и производством такой техники, в частности существует несколько вариантов этих погрузчиков.

Фронтальный погрузчик МКСМ-800

Современный мини-погрузчик МКСМ-800 благодаря небольшим габаритным размерам обладает очень хорошей маневренностью, что позволяет работать в гораздо более быстром темпе, не теряя при этом комфорта. Узкая колея позволяет двигаться там, где обычная строительная техника не может пройти. Минимальная ширина прохода 2.1 метр.

В систему трансмиссии встроены специальные редукторы, с помощью которых погрузчик может плавно изменять скорость своего движения, при этом полностью сохраняя устойчивость перевозимого груза.

Особенности мини-погрузчика

Стоит отметить, что мини-погрузчик МКСМ-800, благодаря модернизированной системе охлаждения и предпусковому подогреву двигателя, может работать в очень широком диапазоне температур. Мотору не страшны ни морозы, ни сильная жара, при этом расход топлива остается в пределах нормы.Для подъемного механизма используются качественные немецкие гидроцилиндры, с очень долгим сроком службы при условии, что нагрузки не превышают предельно допустимых норм по паспорту. Основные характеристики моно включают в себя:

  • маленький размер;
  • маневренность;
  • низкий расход топлива;
  • высокий уровень надежности;
  • комфорт;
  • работают в любую погоду.

Технические характеристики

Для погрузчиков МКСМ-800 технические характеристики достаточно разнообразны и могут меняться в зависимости от конкретного устанавливаемого оборудования или двигателя.Производитель предусматривает установку разных типов двигателей, в частности, серийно используются двигатели CUMMINSA2300 США, а также двигатели HATZ 3M41 немецкой фирмы. Соответственно в техпаспорте оборудование маркируется индексами 800К (с мотором из США) и 800Н (с мотором из Германии). Техническое описание фронтального погрузчика:

  • Мощность двигателя в модели CUMMINS A2300 составляет 44 л/с;
  • Тип двигателя — четырехтактный, дизельный с принудительным жидкостным охлаждением;
  • Грузоподъемность — 800 кг;
  • Рекомендуемая скорость — 10 км/ч;
  • Скорость гидравлики — 75 л/мин;
  • Общий вес — 3022 кг;
  • Объем топливного бака – 75 литров;
  • Максимальное время работы на одном баке около 8.5 часов;
  • Удельный расход дизельного топлива- около 253 грамм/час;
  • Объем основного ковша 0,46 куб.м.;
  • Подъемник стрелы радиальный.

На МКСМ расположены точки крепления для установки дополнительного технического оборудования, в частности ковша, вала уборочного, траншейного экскаватора, грузовой стрелы и т.п.

Особенности дизайна

Рама МКСМ — 800 изготовлена ​​из высоколегированной стали, различной толщины в зависимости от расположения конструктивных элементов. В местах, где сосредоточены наибольшие нагрузки, устанавливаются дополнительные усиливающие пластины. Короткая колесная база 1410 мм с ведущими мостами способствует уровню устойчивости, а также позволяет без особого труда преодолевать небольшие уступы и неровности. Общие габариты загрузчика 2480х1680х2065. Кабина водителя имеет прочное остекление, которое дополнительно защищено специальной металлической сеткой. Производитель устанавливает защиту от солнца и шумоизоляцию салона.

Приобретение и техническое обслуживание специального оборудования

Цена на погрузчики МКСМ-800 достаточно низкая, если сравнивать с зарубежными аналогами, то МКСМ явно выигрывает по цене и качеству. Кроме того, удалось избежать проблем с запчастями, благодаря стабильной работе отечественного завода «Курганмашзавод», есть и сервисные службы. Погрузчики могут комплектоваться в зависимости от потребностей покупателя, это могут быть гусеницы, снегоочистители, щетки для очистки дорог, системы бурения скважин и многое другое. В общем, купить Мксм-800 должно каждое производство, которое хочет выполнять свои работы на высоком уровне. Можно выделить основные черты этой техники, а именно неприхотливость, надежность, выносливость, экономичность и удобство в решении различных задач.

Скорость развития машиностроения просто поражает. Теперь любой желающий может приобрести максимально удобное для него оборудование, при этом не тратя на это много денег. Особой популярностью пользуются мини-погрузчики типа МКСМ-800, технические характеристики которых способны удовлетворить любое дорожное предприятие.

Производство

Курганский машиностроительный завод разработал и выпустил совершенно новый автомобиль, изменивший представление о строительной технике. Это предприятие является одним из крупнейших современных производителей в России.Они производят как гражданскую технику, так и работают над разработкой некоторых систем обороны.

Мини-погрузчик МКСМ-800 пользуется популярностью как у отечественного, так и у зарубежного потребителя благодаря своей компактности, высокому уровню экономичности и универсальности. Следует отметить, что данная спецтехника очень проста в эксплуатации и обслуживании.

Область применения

МКСМ-800, технические характеристики которого подходят практически для любых задач, используется в самых различных отраслях современной промышленности, в строительстве, коммунальном хозяйстве и сельском хозяйстве.Использование подобного транспортного средства позволяет выполнять достаточно широкий спектр услуг, связанных с землеустройством, погрузкой или разгрузкой. Если есть необходимость работать в достаточно ограниченном пространстве, то выбор однозначно за МКСМ-800. погрузчики позволяют без проблем выполнять поставленную задачу даже в закрытых помещениях.

Управление

Для управления гидравлическим оборудованием машин используются специальные джойстики, устанавливаемые в салоне кабины. Органы управления могут быть связаны с помощью электронного контроллера или тросового привода.Этот параметр зависит от модификации модели и предпочтений покупателя.

В системе есть общий блок — контроллер. Благодаря ему погрузчик обладает максимальной маневренностью, при этом водителю не нужно прилагать больших усилий при работе с джойстиком. В регламенте, который поставляется с МКСМ-800, технические характеристики предусматривают тип управления автомобилем.

Кабина

МКСМ-800 имеет кабину из цельнометаллического профиля с дополнительно вклеенным стеклом, а также отдельные дефлекторы.Этот тип конструкции отвечает всем современным требованиям безопасности.

Если рассматривать кабину отдельно, то это предварительно собранный агрегат, в котором установлены все необходимые органы управления, а также климатическая система и элементы индикации.

Рама способна защитить рабочего от падающих материалов, а также спасти ему жизнь в случае опрокидывания. На МКСМ-800 запчасти кабины пользуются отдельным спросом, так как она подвержена разного рода нагрузкам и порой не способна выдержать очередной удар.

Интерьер выполнен с использованием современных материалов для защиты от шума и пыли. Внутри используются формованные пластиковые панели, созданные в соответствии с дизайном, что также соответствует параметрам жизнеобеспечения человека, работающего на таком оборудовании.

Техническое обслуживание

Благодаря простоте открывания капота, а также подъема кабины мастера имеют отличный доступ практически ко всем необходимым узлам и агрегатам. Это позволяет достаточно быстро произвести замену неисправного элемента и работы, связанные с обслуживанием МКСМ-800.Запчасти устанавливаются так же легко, как и демонтируются. Благодаря этой возможности погрузчик завоевал почет и уважение среди дорожных и строительных компаний.

Двигатель

На погрузчике МКСМ-800 в зависимости от его модели и модификации дизельный силовой агрегат американского производства марки Cummins, или немецкого Hatz. Отличаются они мощностью, а также способом охлаждения. У американца мощность 51 лошадиная сила, у немца 52,9. Следует отметить, что в первом охлаждение происходит за счет использования жидкостной системы, а во втором – воздушной.

Габаритные размеры

Все основные габариты и масса большинства модификаций МКСМ-800 не отличаются друг от друга. Единственным исключением является модель с индексом «А». У последнего автомобиля ширина колеи больше (равна 145 см), в то время как остальные имеют размер 141 см. Другие размеры также отличаются. Длина МКСМ-800 А — 264,5 см, вместо 248,0, как у остальных, ширина — 172 см против 168 см. Высота отличается незначительно, версия «А» на сантиметр ниже — 205.5 см против 206,5 см. В результате увеличения габаритов увеличилась и масса машины. Комплектация «А» имеет массу 3,1 тонны, штатная – 2,8 тонны. Для версии «А» погрузчика МКСМ-800 ремонт может отличаться, так как другие типоразмеры предусматривают несколько иное размещение жизненно важных органов машины.

Оснащение

В зависимости от области применения машины МКСМ-800 может комплектоваться самым разнообразным навесным оборудованием. Все дополнительные кузова изготавливаются двух типов: быстрозажимная стрела, работающая в паре с серийно выпускаемыми модулями, а также отдельное устройство для установки дополнительных устройств, позволяющее работать с навесными модулями от импортных машин. Эта особенность делает MKSM-800 более универсальным. Нет необходимости покупать дорогостоящее импортное оборудование для отдельного рабочего устройства.

Следует обратить внимание на дополнительный комплект траков, идущий в комплекте с МКСМ-800. Их устанавливают для того, чтобы значительно повысить тягово-сцепные параметры при движении по грунту с очень слабой несущей способностью. Гусеницы значительно повышают проходимость машины, все за счет снижения величины удельного давления на почву, а наличие специальных грунтозацепов улучшает тяговое усилие.

Установка осуществляется непосредственно на шины. Чтобы избежать касания гусениц и борта погрузчика, параметр ширины гусеницы увеличен. Это возможно за счет установки дополнительных насадок, размещенных на ступицах.

Ширина гусениц не более 340 мм, при этом удельное давление на грунт всего 0,5 кг на квадратный сантиметр. Вес дополнительного модуля может варьироваться, но не более 117 кг.

Цена

Несмотря на популярность МКСМ-800, его цена не столь демократична и может варьироваться в зависимости от типа силового агрегата.Версия с обойдется примерно в 1 419 000 рублей, а версия с силовой установкой Hatz – чуть дороже 1 597 000 рублей. Но полтора миллиона за МКСМ-800 — это не окончательная цена. В зависимости от типа и вида работ, соответствующее рабочее оборудование, за которое также нужно платить отдельно. Например, обычный ковш объемом 0,46 куб. будет стоить 25тыс. Соответственно стоят более сложные модули: 360 тысяч за гидромолот и 230 тысяч за гидромолот.

МКСМ 800 — погрузчик российского завода, широко известного как производитель доступной погрузочной техники. Рассматриваемая модель представляет собой универсальную подсобную строительную машину, предназначенную для решения широкого круга задач, несмотря на свои компактные габариты. Этот прибор, как и многие другие представители модельного ряда МКСМ, успешно прошел все заводские ресурсные испытания и приспособлен в первую очередь к суровым климатическим условиям – например, для работы в северных регионах России. Также автомобиль подойдет и для эксплуатации при повышенных температурах.Пользователи высоко оценили преимущества этой модели, представленные в этой статье. Также рассмотрены основные параметры, особенности эксплуатации и стоимость мини-погрузчика МКСМ 800.

Назначение

МКСМ-800 широко используется в операциях, где необходимо быстро и качественно погрузить и транспортировать грунт и другие сыпучие материалы, а также различные бетонные конструкции. Также машина прекрасно справляется с бурением скважин, рытьем траншей, а также уборкой тротуаров, скверов, парков и промзон, городских и пригородных трасс.Устройство очищает поверхность от мусора, пыли, свежевыпавших и слежавшихся сугробов. Благодаря своим компактным размерам машина пользуется повышенным спросом на закрытых складах, а также в труднодоступных условиях — там, где нужна повышенная маневренность. Погрузочно-разгрузочные работы, а также транспортировка и уборка – все эти и многие другие задачи можно возложить на МКСМ-800, оснастив его необходимым навесным оборудованием.

Видео

Приложение

  • Накладные гусеницы — это приспособление очень выручает в ситуациях, когда необходимо проехать сложное внедорожное препятствие — колея, яма, раскисший грунт, подъем и т.п.Помимо улучшения проходимости, гусеницы помогают снизить давление на грунт. Накладные гусеницы не требуют профессиональных навыков при их установке или демонтаже.
  • Цельнолитые колеса — одна из наиболее доступных альтернатив накладным гусеницам, а также идеальная замена стандартным колесам. Преимущество цельнолитых колес заключается в их глубоком протекторе и цепких свойствах. С такими покрышками практически исключены пробуксовки и пробуксовки. Толстая резина увеличивает массу мини-погрузчика, и в то же время увеличивает его грузоподъемность.
  • Экскаваторный — превращает мини-погрузчик в полноценный мини-экскаватор с гидравлическим поворотом. Он монтируется по типу All-Tach, как и любое другое навесное оборудование.
  • Ведро для снега — приспособление для уборки снежных заносов, сугробов. Подходит для уборки рыхлых и сухих сугробов, а также утрамбованного или мокрого снега. Существуют определенные версии ковша в зависимости от объема – до 1,5 куб. м.
  • Челюстной ковш — представляет собой конструкцию из двух рабочих «челюстей», которые сцепляются друг с другом и таким образом обеспечивают плотное удержание груза, чтобы он не выпадал при транспортировке.В частности, в такое ведро можно погрузить листву, почву, песок и другие сыпучие материалы.
  • Ведро бетоносмесительное — устройство для быстрого приготовления бетонной смеси, а также других дополнительных добавок, улучшающих качество асфальтобетонного покрытия. Загрузка материала в ковш производится вручную или путем черпания смеси с земли, а для выгрузки используется нижний выгрузной люк, к которому крепится спускной рукав, обеспечивающий легкую выгрузку. Такое устройство отлично зарекомендовало себя в строительстве и ремонте дорог, а также в сельском хозяйстве.
  • Щетка — популярная насадка для коммунальных предприятий, позволяющая за короткое время убрать мелкий мусор, листву, песок, пыль и т. д. Этот вариант хорошо подходит для тротуаров, дорожных скверов и общественных мест с большим скоплением людей, а также для уборки городских и проселочных дорог, парков и парковок.
  • Роторная косилка – это приспособление для выравнивания поверхности. Например, он прекрасно подходит для скашивания травы и ненужных зеленых насаждений — сорняков, кустарников и прочих зарослей. Конечно, с сорняками и разросшейся травой роторная косилка справляется гораздо быстрее, чем в случае с ручной косилкой.
  • Асфальтоукладчик навесной вариант для укладки асфальта, разбрасывания бетонного материала, обратной засыпки траншей и т.д. Этот вариант незаменим при строительстве городских, пригородных и даже международных транспортных развязок.
  • Культиватор предназначен для следующих почвенных работ: посадки газонов и другой травянистой растительности. Культиватор способен работать на глубине до 155 мм.
  • Навесной/бульдозерный отвал, способный превратить погрузчик МКСМ в полноценный мини-бульдозер.Это удобное приспособление для работы с большими объемами сугробов, а также с мусором, пылью, листвой. По сути, бульдозерный отвал способен заменить более тяжелые и габаритные машины узкого профиля, которые не способны работать в труднодоступных условиях.
  • Трансплантолог для деревьев — средство для решения самых разных задач, включающих в себя пересадку деревьев с одного места на другое. Оборудование оснащено специальными ножами, которые погружаются в почву таким образом, чтобы не повредить корневую систему дерева.Таким образом, дерево останется целым и невредимым после работ, связанных с его выкапыванием, упаковкой и пересадкой с одного места на другое.
  • Захват для бревен — приспособление для захвата бревен и других цилиндрических предметов. Захват прочно удерживает бревна, чтобы они не выпадали во время транспортировки. Максимальная грузоподъемность захвата для бревен составляет 1 тонну.
  • Снегоуборщик — приспособление для работы со снежным покровом высотой до 740-750 мм. При этом дальность выброса снега может быть увеличена до 6 метров.Снегоуборщик оснащен специальной пластиной, предотвращающей забивание липким снегом.

Характеристики устройства

  • Мини-погрузчик МКСМ-800 способен разворачиваться на одном месте. Возможен плавный набор скорости, без различных рывков и вибраций. Операции по управлению погрузчиком просты и не требуют привыкания, ведь для управления навесным оборудованием предусмотрена лишь пара джойстиков, расположенных на боковых панелях.
  • Машина существует в нескольких версиях.Так, модификация 800К оснащается на выбор дизельными двигателями Cummins или John Deere, тогда как версия с индексом «H» получила мотор от Harz. На сегодняшний день более новой версии А с конструктивными изменениями среди которых можно выделить прочную сварную раму. Также разработчики отказались от установки устаревшего привода насоса. В комплектацию входит сцепление, что способствует надежной работе двигателя при минусовых температурных нагрузках.

  • Стандартная модель МКСМ-800 получила экономичную силовую установку с удельным расходом топлива 220 кВт/кВтч.Можно выбрать для установки моторы John Deere и Harz, хорошо зарекомендовавшие себя в суровых северных условиях. Они способны работать при температуре от минус 20 до плюс 50 градусов. Ресурс обоих двигателей составляет 8000 часов. Максимальная скорость составляет 10 км/ч, а емкость топливного бака достигает 55 литров. Автомобиль получился компактным – его длина составляет 2480 мм, а ширина – 1680 мм.
  • В остальном одноименный мини-погрузчик комплектуется отечественными комплектующими.Например, гидросистема для модели МКСМ-800, производится в Коврове, Салавате и Парголово. Сменить необходимые насадки можно за считанные минуты – в качестве креплений используется быстросъемный зажим. В результате нет необходимости использовать специальные инструменты.

  • Цельнометаллическая кабина МКСМ-800 изготовлена ​​из толстой стали. Жесткое крепление кабины к раме обеспечивается сайлентблоками. При необходимости кабина откидывается, и таким образом открывается доступ к узлам и агрегатам, которые просты и удобны в обслуживании.Сама кабина спроектирована эргономично – например, что такое широкий дверной проем, а также дополнительная ступенька, позволяющая легко забраться в кабину. По сути, дверь — это передняя стенка кабины, а на боковых панелях есть крючки, на которые можно повесить одежду. Главной особенностью внутреннего убранства каюты являются, конечно же, подрессоренные кресла. Его можно регулировать в различных диапазонах — впрочем, то же самое касается и регулируемой рулевой колонки. Все приборы управления, включая контрольно-измерительные датчики и приборы, расположены максимально близко к водителю.Также в кабине предусмотрена специальная ниша для хранения инструментов. Передняя часть остекления расширена за счет бокового остекления, что обеспечивает практически круговой обзор. Также отмечают современную шумоизоляцию моторного отсека и салона, благодаря которой водитель почти не отвлекается от шума и вибрации, меньше устает и может работать намного дольше. Окна и двери можно заменить защитными решетками, чтобы облегчить общий вес кабины. В то же время таким образом можно повысить безопасность, поскольку защитные решетки защищают оператора в случае опрокидывания.

Технические характеристики

  • Грузоподъемность/общий вес — 800/2800 кг
  • Название двигателя — 5201.22
  • Параметры двигателя — дизель, 3 цилиндра, 46 л. с., проявитель — Zetor
  • Скорость — 10 км/ч (максимальная)
  • Клиренс — 205 мм
  • Размеры, мм: 3270/1680/2065
  • Высота точки подвеса ковша — 3060 мм
  • Емкость топливного бака — 55 литров
  • Высота разгрузки — 2410 мм
  • Передняя/задняя колея – 1410 мм
  • Угол подъема — 13 градусов
  • Радиус поворота — 2440 мм
  • сиденье — да
  • Рабочий орган/ходовая часть — ковш/колеса.

Цена

Средняя стоимость мини-погрузчика МКСМ-800 на российском рынке составляет 1 миллион 100 тысяч рублей за экземпляр в состоянии б/у.

ФЕРМЕНТНЫЙ КОМПЛЕКС НИЛЬСКОЙ ТИЛАПИИ КОРМЛЕННОЙ, ДОБАВЛЕННЫЙ НА РАЗНЫХ УРОВНЯХ И ЭТАПАХ ОБРАБОТКИ1

ВВЕДЕНИЕ

Тилапия обладает многими благоприятными характеристиками для целей рыбоводства, такими как выносливость и простота содержания. Он очень плодовит, продуктивен, и его искусственное воспроизводство было усилено, что позволяет производить мальков в течение всего года (ЭЛЬ-САЙЕД, 2006).Также, по данным того же автора, эта рыба способна приспосабливаться к различным системам промысла, диетам, а также кормовому планктону, имеющемуся на среде; также имеет мясо с отличными питательными качествами и высокой товарной стоимостью.

Аквакультура зарекомендовала себя во всем мире как система производства продуктов питания, побуждающая культуристов и исследователей искать методы, способные повысить прибыль и производительность. Таким образом, пищевые добавки можно считать весьма перспективными, поскольку, по мнению Кампестрини, Сильвы и Аппета (2005), они предназначены для сохранения, улучшения или изменения свойств пищевых продуктов, не влияя на их пищевую ценность.

Среди альтернатив ферменты можно считать одним из наиболее многообещающих кандидатов, поскольку они повышают доступность питательных веществ и энергии, что приводит к повышению производительности и сокращению отходов (JEGANNATHAN; NIELSEN, 2013). Как и другие животные с однокамерным желудком, рыбы не способны метаболизировать некоторые питательные вещества из-за недостаточной выработки или отсутствия специфических ферментов (TANIGUCHI; TAKANO, 2004), что оправдывает их включение в рацион.

Во время деградации субстрата различные ферменты могут действовать согласованно для эффективного пищеварения.Как и в случае ферментного комплекса SSF (твердофазное брожение), некоторые ферменты объединяются естественным и равномерным образом, например, бета-глюкозидаза, пектиназа, ксиланаза, эндоглюканаза, амилаза, протеаза и фитаза (CHAUYNARONG et al., 2008). .

На активность ферментов, добавляемых в рацион животных, может влиять несколько факторов, таких как химические вещества, pH и, главным образом, колебания температуры (CARLSON; POULSEN, 2003). В рыбоводстве широко используются экструдированные корма; такие диеты разрабатываются с помощью процесса, связанного с высокими температурами.Таким образом, в этом случае следует осторожно добавлять ферменты, поскольку из-за белкового состава может произойти частичная или полная потеря биологической активности.

Таким образом, в этом исследовании оценивалась стабильность ферментов (комплекс SSF) на этапах процесса экструзии и последующее влияние на производительность нильской тиляпии (Oreochromis niloticus).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Это исследование проводилось с мая по июль 2014 года с разрешения местного совета по этике.Основной рацион готовили на комбикормовом заводе и экструдере с использованием ингредиентов растительного происхождения. Используемый ферментный комплекс Allzyme SSF производства Alltech Inc. (Николасвилл, Кентукки, США) содержит ферменты β-глюкозидазу, пектиназу, ксиланазу, эндоглюканазу, амилазу, протеазу и фитазу.

Для анализа ферментативной активности использовали основной корм (Таблица 1) во всех обработках, различающихся только этапами и уровнями включения. Лечение заключалось в замене добавок с SSD от 4 до 8% от основного рациона следующим образом: контроль (без фермента), 4000 ppm SSF перед экструзией (BE4), 8000 ppm SSF перед экструзией (BE8), 4000 ppm после экструзии (AE4). ) и 8000 SSF после экструзии (AE4).Уровни включения SSF до и после были в десять раз выше, чем те, которые использовались для тестов производительности. Эти более высокие уровни объясняются сложностью извлечения ферментов и количественной оценки их активности с помощью используемых в настоящее время методов (ESMAEILIPOUR et al., 2012).

Все процедуры имели в своем составе желе, чтобы предотвратить какое-либо влияние на ингредиентную основу, отличающуюся только моментом включения.

При обработках ферментами, добавленными перед процессом экструдирования, и контролем (без фермента) желе включалось в смесь и отличалось только уровнем включения SSF (0, 4000 и 8000 ppm).Однако для обработок с включением фермента после процесса экструзии (4000 и 8000 частей на миллион) желе готовили и смешивали с ферментным комплексом, таким образом, наращивая его «сверху». Все корма обрабатывали на экструдере (Inbramaq, MX40) с получением гранул со средним диаметром 2 мм при 90°С с последующей сушкой. Наконец, образцы измельчали ​​и разделяли для ферментативного анализа.

Первое испытание

Для определения активности ферментов 0,5 г образца каждой диеты мацерировали 10 мл дистиллированной воды.Этот материал помещали в полиэтиленовые пробирки для центрифугирования при 13000 об/мин в течение 10 минут. Затем надосадочную жидкость отбирали пипеткой для определения активности фермента. Все ферментативные анализы проводили в трехкратной повторности. Для анализа были отобраны следующие ферменты, входящие в состав комплекса, входящего в состав корма: b-гликозидаза, пектиназа, ксиланаза, эндоглюканаза (карбоксиметилцеллюлаза), амилаза, протеаза и фитаза.

Таблица 1.

Состав экспериментальных рационов (натуральные вещества).

Ингредиенты (%)   Лечение  
  Управление ВЕ4 и АЕ4 BE8 и AE8
Соевый шрот 71,88 71,88 71,88
Кукуруза 20.12 20.12 20.12
Пшеничные отруби 3,00 3,00 3,00
Дикальцийфосфат 2,83 2,83 2,83
Известняк 0,76 0,76 0,76
Соевое масло 0.20 0,20 0,20
Витаминно-минеральная добавка (1) 0,50 0,50 0,50
Витамин С 0,05 0,05 0,05
Соль 0,50 0,50 0,50
Инертный* 0.08 0,04
SSF (2) 0,04 0,08
Желе (4) 0,06 0,06 0,06
BHT (3) 0,02 0,02 0,02
Рассчитано (5) и проанализировано (6) Состав      
Сухое вещество (6) 87.38 87,45 87,24
Сырой протеин (6) 33,31 34.02 34,05
Минеральные вещества (6) 5,99 6,04 6,06
Усвояемая энергия (ккал/кг) (5) 3000 3000 3000
Сырое волокно (5) 4.92 4,92 4,92
Эфирный экстракт (6) 1,69 1,87 1,71
Кальций общий (6) 1,12 1,09 1.10
Общий фосфор (6) 1,71 1,65 1.69
Общий лизин (5) 2,07 2,07 2,07
Линолевая кислота (5) 1,06 1,06 1,06

β-глюкозидаза представляет собой экзоцеллюлазу со специфичностью в отношении различных субстратов. Этот фермент гидролизует невосстанавливающий конец β-гликозидов, высвобождая глюкозу.В этом анализе мы использовали 100 мкл экстракта фермента, 100 мкл буфера ацетата натрия (100 мМ, рН 5) и 250 мкл раствора 2 мМ синтетического субстрата. Реакцию проводили в течение 15 минут при 50 °C и парализовали 500 мкл карбоната натрия (0,5 М). Затем раствор переносили на спектрофотометр для измерения поглощения при 410 нм и, таким образом, определения активности фермента.

Для пектиназы мы использовали 25 мкл экстракта фермента, 75 мкл буфера ацетата натрия (100 мМ, рН 5) и 400 мкл раствора галактуроновой кислоты (0.25% масс./об.). Реакцию проводили в течение 30 минут при 50 °C и парализовали 500 мкл реагента DNS (3,5-динитросалициловая кислота), а затем инкубировали на кипящей водяной бане в течение 5 минут для развития окраски. После этого растворы центрифугировали в полиэтиленовых пробирках при 13000 об/мин в течение 5 минут. Раствор переносили на спектрофотометр для измерения поглощения при 540 нм и затем для определения активности фермента.

Активность ксиланазы определяли с использованием 80 мкл буфера ацетата натрия (100 мМ, pH 5), 20 мкл ферментного экстракта и 400 мкл раствора ксилана из древесины березы (1.25% мас./об.). Реакцию проводили в течение 15 минут при 50 °C, парализуя 500 мкл DNS, а затем инкубировали на кипящей водяной бане в течение 5 минут для развития окраски. Раствор переносили на спектрофотометр для измерения поглощения при 540 нм и определения активности фермента.

Для эндоглюканазы (карбоксиметилцеллюлазы) 25 мкл раствора фермента смешивали с 400 мкл карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) (1,25% мас./об.), разводя в 75 мкл буфера ацетата натрия (100 мМ, рН 5). Этот раствор помещали на водяную баню при 50°C на 30 минут, после чего реакцию парализовали 500 мкл DNS по Миллеру (1956).Эти растворы помещали в кипящую воду на 5 минут и затем измеряли оптическую плотность при 540 нм на спектрофотометре для оценки ферментативной активности.

Активность α-амилазы была основана на высвобождении молекул мальтозы и декстрина при гидролизе крахмала. При добавлении йода негидролизованный крахмал приобретал синюю окраску. Активность амилазы обратно пропорциональна интенсивности синей окраски и рассчитывается путем сравнения со стандартным образцом (контроль).Оптическую активность определяли на спектрофотометре при длине волны 660 нм с использованием колориметрического набора амилазы Bioclin по Caraway (1959).

Что касается протеазной активности, 150 мкл азоказеина (2%) инкубировали при 37 °C со 125 мкл ферментного экстракта в течение 30 минут. Затем к смеси добавляли 600 мкл ТХУ (10% трихлоруксусной кислоты) и оставляли на 15 минут на бане со льдом. После этого смесь центрифугировали в течение пяти минут при 14000 об/мин с отделением надосадочной жидкости.Аликвоту супернатанта (600 мкл) переносили в пробирку, содержащую 700 мкл 0,1 М NaOH, для измерения поглощения при 440 нм на спектрофотометре. Затем определяли активность протеазы.

Для активности фитазы количество неорганического фосфата, высвобождаемого из субстрата фитата натрия, измеряли. Мы использовали 600 мкл субстрата фитата натрия (1,5 мМ) в 100 мМ буфере ацетата натрия (pH 5,0) и 150 мкл ферментного экстракта. В течение 30 минут смесь выдерживали на водяной бане при 50°С, останавливая реакцию добавлением 250 мкл трихлоруксусной кислоты 10% (об./об.).Затем в пробирки для анализа добавляли 1000 мкл колориметрического реагента. Этот реагент готовили из 10% раствора молибдата аммония (масса/объем) в 5 М растворе серной кислоты. Реагент готовили во время использования, смешивая 10% (об./об.) колориметрического реагента, 5% сульфата железа (вес./об.) и деионизированную воду. Затем измеряли поглощение на спектрофотометре при 700 нм, сопоставляя значения со стандартной кривой из KH 2 PO 4 .

Второе испытание

Второе испытание состояло из оценки продуктивности животных.Оно проводилось в Лаборатории аквакультуры и водной экологии Федерального университета Валеш-ду-Жекитинхонья и Мукури (UFVJM) в Диамантине, штат Массачусетс, Бразилия. Исследование проводилось в 2013 году в течение восьми недель (56 дней) с использованием нильской тиляпии, предоставленной CODEVASF (Janaúba — MG, Бразилия). В испытании использовали 200 молодых особей нильской тиляпии штамма GIFT с измененным полом со средней исходной массой 10,37 ± 0,38 г. Вначале для каждой обработки измеряли первоначальный вес и биомассу (г).Рыба была распределена по двадцати 35-литровым аквариумам, из которых 7 -1 и 0,20 -1 , с рециркуляционной системой, содержащей ультрафиолетовый (УФ) фильтр, с постоянной аэрацией, температурным контролем, естественной фотопериод и условия биофильтрации. Резервуары очищали три раза в неделю методом сифонирования, обновляя 30% объема резервуара.

Молодь подвергали пяти диетам (обработкам): без фермента (контроль), с добавлением 400 и 800 ppm SSF перед экструзией (BE400 и BE800), с добавлением 400 и 800 ppm SSF после экструзии (AE400 и AE800), распределяя в полностью рандомизированном дизайне с четырьмя повторами по 7 рыб.

Была принята диета на основе растительных ингредиентов с тем же исходным составом, что и в ферментном анализе, в соответствии с рецептурой, приведенной в таблице 1. Рыб кормили вволю (до насыщения) четыре раза в день (8:00, 11:00). утра, 14:00 и 17:00).

Раз в неделю измерялись следующие параметры качества воды: температура, рН, электропроводность, растворенный кислород (многопараметрический зонд YSI Pro Plus) и аммиак (метод индофенолового синего) (APHA, 2012).Количество предложенного и оставшегося корма ежедневно измеряли с помощью точных весов (0,01 г) и оценивали коэффициент конверсии корма.

Через 56 дней испытаний, в единственном биометрическом эксперименте после начального, все тиляпии оставались без пищи 12 часов для опорожнения пищеварительного тракта и анализа состава тела, будучи отловленными и погруженными в воду с добавлением эвгенола (37,5 мг.л — 1 ) около 30 минут на эвтаназию и взвешивание. В этом пункте мы оценивали: выживаемость (%), конечную биомассу (г), прирост биомассы (г), конечный вес (г), прирост веса (г), конверсию корма (г.г -1 ), а удельная скорость роста — СГР (%.сут -1 ).

Туши были высушены в печах с принудительной подачей горячего воздуха и доставлены в Лабораторию питания животных Департамента зоотехники (ДЗО) в UFVJM. Параметры состава тела, такие как сухое вещество (DM), минеральное вещество (MM), сырой протеин (CP), эфирный экстракт (EE), кальций (Ca) и фосфор (P), оценивали в соответствии с методами, описанными Van Soest et al. . (1991).

Данные об активности ферментов и производительности подверглись дисперсионному анализу (ANOVA) при 0.05 вероятность. Средние значения сравнивали с помощью теста Тьюки с использованием программного обеспечения системы статистического анализа (SAS). Данные о выживании были преобразованы в значения арксинуса, но в таблице они представлены в процентах. Для параметров качества воды были рассчитаны средние значения и стандартные отклонения, чтобы охарактеризовать среду выращивания.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Включение SSF в корм для тиляпии перед экструзией приводило к частичной или полной потере активности ферментов, за исключением фитазы, на которую не влияла температура процесса.Обработки показали значительные различия (p<0,05) для b-глюкозидазы, амилазы и протеазы в зависимости от обработок с частичной потерей активности в процессе экструзии.

Значительная разница (p<0,05) наблюдалась для пектиназы, ксиланазы и эндоглюканазы в отношении тестируемых уровней. Активность этих ферментов полностью терялась во время обработки, и не было никакой разницы по сравнению с контролем (таблица 2).

Включение 8000 ppm SSF после экструзии повышало активность фермента по сравнению с активностью до экструзии и контролем.Добавление 8000 частей на миллион SSF перед экструзией показало такое же поведение, как и 4000 частей на миллион после экструзии, которое не имело различий с самой высокой дозой включения после экструзии.

Таблица 2.

Ферментативная активность ферментного комплекса SSF, добавляемого на разных уровнях и этапах процесса экструзии для рационов нильской тиляпии.

Лечение CV (%)
Ферменты Управление ВЕ4 ВЕ8 АЕ4 АЕ4
0.17 80,00 144.00 264,00 680.00
β-глюкозидаза 1,2 ±0,01e ±1,20d ±32,00с ±8,00b ±8.00a 6,93
0,69 0,36 0,58 11264.36 13127.41
Пектиназа 1,2 ±0,06с ±0,03с ±0,02с ±282,40b ±416,30а 5,45
0,63 0,75 0,49 168,21 216,30
Ксиланаза 1,2 ±0.23с ±0,24с ±0,03с ±14,25b ±14,44а 22,82
0,49 0,44 0,41 255,88 316.11
Эндоглюканаза 1,2 ±0,07с ±0,18с ±0.06с ±102,35b ±126,84а 6,13
9,48 77,90 128,43 145,97 252,64
Амилаза 1,3 ±7,44d ±5,95с ±20,84б ±23,18б ±11.90а 11,98
907,42 915,37 997,58 1123.02 1236.15
Протеаза 1,2 ±0,10с ±0,02с ±0,01bc ±0,02аб ±0,01а 4,50
0.8162 313,33 594,33 327,33 608,33
Фитаза 1,4 ±0,26с ±7,23b ±18,23а ±12,74b ±16,25а 3,54

После анализа ферментов продуктивность нильской тиляпии оценивалась в течение 56 дней.Таблицы 3 и 4 отображают качество воды и рабочие параметры соответственно.

Были различия между обработками (p<0,05) по конечной массе, привесу, конверсии корма и SGR. Однако не было обнаружено никаких различий в отношении конечного веса и прироста веса между вариантами лечения с включением SSF после экструзии. Более того, добавление 800 ч/млн SSF перед экструзией не отличалось от добавления 400 ч/млн после экструзии. Таким образом, рыба, получавшая AE800, получила прирост массы на 40,29% и 18,43% больше (p>0.05) по сравнению с контролем и ВЕ800 соответственно.

Таблица 3.

Переменные качества воды, полученные в течение экспериментального времени.

Параметры Средние значения CV (%)
рН 6,56 ± 0,17 3,41
Суммарный аммиак (мг.л -1 ) 0.19± 0,11 7,93
Температура (ºC) 27,05 ± 1,34 4,28
Растворенный кислород (ч/млн) 9,03 ± 1,87 3.01
Электропроводность (См.см -1 ) 40,90 ± 9,90 2,82

По конверсии корма были различия (p>0.05) среди обработок. Примечательно, что любая из диет, дополненных SSF, показала улучшенную конверсию, при этом AE800 был наиболее эффективным лечением.

Включение

SSF и экструзионная обработка также влияли на SGR (p <0,05), среди которых DE800 усиливал рост тиляпии. Таким образом, конверсия корма и результаты SGR были лучше в варианте ДЭ800, выше на 31,96 и 22,22% по сравнению с контролем соответственно.

С другой стороны, эффекта не было (p>0.05) уровней включения SSF на конечную биомассу, прирост биомассы и выживаемость. Точно так же включение не повлияло (p>0,05) на состав тела нильской тиляпии (таблица 5).

Таблица 4.

Эффективность рационов молоди нильской тиляпии, содержащих ферментный комплекс SSF, добавленный на разных этапах обработки корма

Переменные Лечение CV (%)
Управление БЕ400 BE800 АЕ400 АЕ800
Начальный вес (г) 10.50 10,34 10,33 10,36 10,34 4.10
Окончательный вес (г)* 33.63с 34.89с 37.74bc 39.61аб 42.79а 5,58
Прибавка в весе (г)* 23.13с 24.55с 27.40bc 29.25аб 32.45а 8.18
Конверсия корма (г/г)* 1.22c 1.03b 1.01b 0,95б 0,83а 4,44
Исходная биомасса (г) 73,48 72,38 72,34 72,50 72.36 4.10
Конечная биомасса (г) 219,07 237,35 236,80 237,65 277,67 11.10
Прирост биомассы (г) 150,75 170,09 169,66 175,51 210,36 14.06
Удельный темп роста (%) 2.07б 2.23аб 2.22аб 2.38аб 2.53а 4,95
Выживший (%) 92,85 92,85 92,85 85,70 92,85 8.07

Таблица 5.

Состав тела молоди нильской тиляпии, получавшей рацион, содержащий ферментный комплекс SSF, добавленный на разных этапах обработки корма.

Переменные Лечение
Управление БЕ400 BE800 АЕ400 АЕ800
Сухое вещество (%) 20.78 19,98 18,57 19,46 19,85
Минеральные вещества (%) 13,26 13,73 13,46 12,53 12,63
Общий кальций (%) 3,53 3,83 3,63 3,25 3,22
Сырой жир (%) 13.33 13,51 13,35 13,28 13,27
Сырой белок (%) 56,68 55,84 56,07 56,28 55,50
Общий фосфор (%) 2,03 2,49 2,17 2,14 2.11

Нагрев при приготовлении корма для экструдера способствует частичной денатурации ферментного комплекса SSF.Однако его можно добавить на более высоких уровнях, чтобы компенсировать эти потери. Тем не менее, для улучшения реакции его следует добавлять после экструзии, поскольку он обеспечивает лучшую производительность животных и меньшее количество и сложность отходов.

b-глюкозидаза представляет собой тип целлюлазы, которая действует в конечном процессе разложения целлюлозы путем гидролиза целлобиозы (AJWA; TABATABAI, 1994). Мы наблюдали, что активность b-глюкозидазы частично снижалась при экструзии. Этот результат аналогичен полученному Passos et al.(2008), которые наблюдали снижение активности b-глюкозидазы при высоких температурах. Ферменты представляют собой белки и поэтому могут быть частично денатурированы высокими температурами в процессе экструзии.

Гомес и др. (2007) упомянули, что пектиназа и ксиланаза являются ключевыми ферментами, участвующими в деградации клеточной стенки. Пектиназа гидролизует пектин, присутствующий в средней пластинке и первичной стенке растительных клеток. Однако ксиланаза действует на молекулы ксилана по эндогенным и экзогенным механизмам, разлагая гемицеллюлозу, которая является одним из основных компонентов клеточных стенок растений.Те же авторы также указали, что высокая температура может вызвать полную потерю пектиназной и ксиланазной активности, как показано в анализе ферментативной активности, разработанном в этом исследовании.

Это ферментативное поведение также подтверждает выводы Uenojo и Pastore (2007), которые подчеркнули максимальную активность пектиназы при 50 °C; они также заявили, что при этой температуре активность фермента имеет тенденцию к снижению или прекращению, как это наблюдается здесь. При оценке ксиланаз из различных источников и их включения в рационы на основе пшеницы Reis et al.(2001) подтвердили, что некоторые типы ксиланазы имеют пик активности при 75 °C, другие — при 50 °C, при этих оптимальных температурах активность имеет тенденцию снижаться или исчезать, как это наблюдалось в этом исследовании.

Эндоглюканаза

отвечает за запуск гидролиза целлюлозы и за случайное расщепление внутренних гликозидных связей целлюлозной цепи (лигноцеллюлозного волокна), делая их более открытыми. Подобно пектиназе и ксиланазе, для эндоглюканазы требуется строгий контроль температуры процесса для предотвращения ее денатурации (NELSON; COX, 2014).В этом исследовании мы наблюдали полную потерю активности эндоглюканазы из-за условий процесса экструзии.

Амилаза представляет собой пищеварительный фермент панкреатического происхождения, который воздействует на полисахариды в химусе и проникает в просвет двенадцатиперстной кишки (MOURA et al., 2007). В исследовании, характеризующем активность амилазы кукурузного солода, Biazus et al. (2006) отметили частичное снижение активности этого фермента при температуре выше 90°C с оптимальной точкой при 55 o °C. Эти результаты подтверждают результаты настоящего исследования, в котором активность амилазы частично снижалась из-за процесса экструзии.

Что касается протеазы, Giongo (2006) упомянул широкий спектр физиологических функций, выполняемых этим ферментом, ведущих основные метаболические и регуляторные функции посредством катализа деградации белка. Этот автор также сообщил о частичной потере ферментативной активности при повышении температуры, что подтверждает результаты этого исследования.

Фитаза воздействует на фитиновую кислоту в растительных ингредиентах, биодоступность фосфора и других минералов, связанных с этим соединением.(ЧЕНГ; ХАРДИ, 2002). Изучая фитазу, полученную из семян подсолнечника, Агостини и Ида (2006) подтвердили отсутствие потери активности фитазы в диапазоне температур от 30 до 50°С. (2012) заметили, что стабильность фермента ухудшается при температуре выше 80 °C, что близко к температуре экструзии, используемой в этом испытании.

Во время эксплуатационных испытаний система рециркуляции поддерживала качество воды на том же уровне, что наблюдал Кубица (2000), который рекомендовал диапазон температур 28-32 °C, pH 6.5-8,0, общий аммиак 0-0,50 мг.л -1 , проводимость 23-71 мкСм.см -1 , растворенный кислород >5,0. Эти диапазоны были аналогичны тем, которые были обнаружены в этом исследовании (таблица 4), в пределах которых не было никаких помех для роста животных.

Vieille и Zeikus (1996) подчеркнули, что высокие температуры могут влиять на ферментативную активность большинства экзогенных ферментов, что приводит к снижению их биологической активности. Такое же поведение наблюдалось в этом исследовании с последующим влиянием на конечный вес, прирост веса, конверсию корма и удельную скорость роста.

Тем не менее, конверсия корма улучшалась при добавлении ферментного комплекса после экструзии (AE800), что свидетельствует о частичной потере биологических характеристик продукта. Этот результат может быть подтвержден путем анализа данных по активности b-глюкозидазы и амилазы, которые частично утратили свою функциональность, а также данных по активности фитазы, которые не показали влияния воздействия процесса экструзии.

Другие эксперименты с добавлением ферментов для тиляпии подтверждают идею улучшения использования питательных веществ, что приводит к повышению продуктивности животных (MOURA et al., 2007). Короче говоря, согласно литературным данным, сокращение времени производства и, следовательно, стоимости конечного продукта (BELAL; KHALAFALLA, 2011; CAMPESTRINI; SILVA; APPET, 2005).

Анализируя те же виды рыб, Moura et al. (2007) заметили, что добавление 150 частей на миллион SSF в рацион улучшало прирост веса животных в зависимости от увеличения биодоступности питательных веществ, как это наблюдалось в настоящем исследовании. В другом исследовании Белал и Халафалла (2011) подтвердили, что сеголетки нильской тиляпии, получавшие рацион с травами и добавлением SSF вместо кукурузы, способствовали улучшению роста и эффективности корма, как и в настоящем исследовании.

Что касается состава тела, Signor et al. (2010) также не наблюдали различий, за исключением эфирного экстракта, который имел линейное снижение при добавлении ферментного комплекса (амилазы, протеазы, целлюлазы, липазы, пектиназы, ксиланазы, β-глюканазы и фитазы) для нильской тиляпии. В эксперименте с микробной фитазой Oliva-Teles et al. (1998) не обнаружили различий в составе тела молоди морского окуня (Dicentrarchus labrax).

Роча и др. (2007), изучая различные уровни ферментных добавок (микробной фитазы) для мальков серебристого сома (Rhamdia quelem), обнаружили схожий состав тела.Эти авторы не сообщили о существенной разнице в следующих питательных веществах: сухом веществе, минеральном веществе и сыром протеине. Сильва и др. (2007), изучая молодь нильской тиляпии при различных уровнях добавок жидкой фитазы, не обнаружили статистических различий в уровнях кальция.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Все ферменты комплекса SSF снижают или теряют свою каталитическую активность, если их добавляют перед процессом экструзии, за исключением фитазы. Он оказывает влияние на производительность нильской тиляпии, так как 800 частей на миллион являются лучшим уровнем для добавления в рацион после процесса экструзии.

БЛАГОДАРНОСТИ

В Координацию повышения квалификации кадров высшего образования (CAPES), в Национальный совет по научно-техническому развитию (CNPq) для предоставления стипендий, в Фонд поддержки исследований штата Минас-Жерайс (FAPEMIG), в Бразильский Северо-Восточный банк ( BNB) за финансовую поддержку и Alltech Inc. за предоставление ферментного комплекса Allzyme SSF.

ССЫЛКИ

АГОСТИНИ, С. Дж.; IDA, EI Caracterização parcial e utilização da fitase extraída de sementes germinadas de girassol.Pesquisa agropecuária brasileira, Brasília, v. 41, n. 6, с. 1041-1047, 2006.

АДЖВА, Х.А.; Табатабай М. А. Разложение различных органических веществ в почвах. Биология и плодородие почв, Эймс, т. 18, н. 3, с. 175-182, 1994.

АМЕРИКАНСКАЯ АССОЦИАЦИЯ ОБЩЕСТВЕННОГО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ — APHA. Стандартные методы исследования воды и сточных вод. 22. изд. Вашингтон: Федерация водной среды, 2012. 496 с.

БЕЛАЛ, Э. Б.; KHALAFALLA, MME Биодеградация остатков Panicum repens с помощью Pleurotus ostreatus для его использования в качестве нетрадиционного корма в рационах Oreochromis niloticus.Африканский журнал микробиологических исследований, Лагос, т. 5, н. 19, с. 3038-3050, 2011.

BIAZUS, J.P.M. et al. Caracterização da atividade amilásica do malte de milho (Zea mays). Acta Scientiarum: Technology, Maringá, т. 28, н. 1, с. 13-19, 2006.

КАМПЕСТРИНИ, Э.; СИЛЬВА, В. Т. М.; APPET, MD Utilização de enzimas na alimentação animal. Revista Eletrônica Nutritime, Viçosa, т. 2, н. 6, с. 254-267, 2005.

CARAWAY, W. T. Стабильный крахмальный субстрат для определения амилазы в сыворотке и других жидкостях организма.Американский журнал клинической патологии, Оксфорд, т. 32, н. 1, с. 97-99, 1959.

КАРЛСОН, Д.; ПОУЛСЕН, Х. Д. Разложение фитатов в пропитанных и ферментированных жидких кормах: влияние рациона, время замачивания, термическая обработка, активность фитазы, рН и температура. Наука и технология кормов для животных, Мадрид, т. 103, н. 1-4, с. 141-154, 2003.

CHAUYNARONG, N. et al. Влияние добавки экзогенного микробного фермента на потребление корма, рост тела и развитие фолликулов у кур-несушек на кукурузно-соевом рационе.Международный журнал птицеводства, Шампейн, т. 7, н. 3, с. 257-262, 2008.

ЧЭН, З. Дж.; ХАРДИ, Р. В. Влияние микробной фитазы на кажущуюся усвояемость питательных веществ ячменем, рапсовой мукой, пшеницей и проростками пшеницы, измеренное in vivo с использованием радужной форели (Oncorhynchusmykiss). Aquaculture Nutrition, Порту, т. 8, н. 4, с. 271-277, 2002.

ЭЛЬ-САЙЕД, ABM Культура тилапии. 1. изд. Александрия: CABI, 2006. 277 с.

ESMAEILIPOUR, O. et al. Влияние температуры, pH, времени инкубации и концентрации пепсина на стабильность in vitro внутренней фитазы пшеничного ячменя и ржи.Наука и технология кормов для животных, Мадрид, т. 175, н. 3-4, с. 168-174, 2012.

GIONGO, JL Характеристика и применение протеаз, производимых линхагенами Bacillus sp. 2006. 95 ф. Dissertação (Mestrado em Agroquímica: Área de concentração em Microbiologia Agrícola e do Meio-Ambiente) — Федеральный университет Риу-Гранди-ду-Сул, Порту-Алегри, 2006.

ГОМЕС, Э. и др. Enzimas termoestáveis: шрифты, производство и промышленное применение. Química Nova, Сан-Паулу, т. 30, н. 1, с.136-145, 2007.

ДЖЕГАННАТАН, К.Р.; NIELSEN, PH. Экологическая оценка использования ферментов в промышленном производстве — обзор литературы. Журнал чистого производства, Амстердам, т. 42, н. 10, с. 228-240, 2013.

KUBITZA, F. Tilápia: technologia e planejamento na produção Comercial. 1. изд. Jundiaí, SP: Edição do author, 2000. 285 стр.

MOURA, G.S. et al. Desempenho е atividade де амилазы эм tilápias-ду-нило submetidas различных температур. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v.42, н. 11, с. 1609-1615, 2007.

МИЛЛЕР, Г. Л. Использование реагента динитросалициловой кислоты для определения восстанавливающего сахара. Аналитическая химия, Вашингтон, т. 31, н. 3, с. 426-428, 1956.

НЕЛЬСОН, Д.Л.; COX, M. Principios de bioquimica de Lehninger. 6. изд. Порту-Алегри, РС: АРТМЕД, 2014. 1328 с.

ОЛИВА-ТЕЛЕС, А. и др. Использование рационов с добавлением микробной фитазы молодью морского окуня (Dicentrarchus labrax). Водные живые ресурсы, Кембридж, т. 11, н.4, с. 255-259, 1998.

PASSOS, S. R. и др. Enzimática Atividade е perfil да comunidade бактерий эм соло субметидо à solarização е biofumigação. Pesquisa agropecuária brasileira, Brasília, v. 43, n. 7, с. 879-885, 2008.

REIS, T.A.F.C. и др. Доступность потенциальных биотехнологических ксиланаз для Clostridum termo cellum и Cellvibriomixtus: sua utilização na suplementação de Dietas à base de trigo para frango de corte. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias, Lisboa, v.96, н. 539, с. 125-134, 2001.

ROCHA, B.C. et al. Suplementação де fitase микробиана на диете де alevinos де jundiá: efeito sobre или desempenho produtivo e как características де carcaça. Ciência Rural, Санта-Мария, д. 37, н. 6, с. 1772-1778, 2007.

СИНЬОР А.А. и др. Desempenho де juvenis де tilápia-ду-нило alimentados ком rações contendo complexo enzimático. Revista Brasileira Zootecnia, Viçosa, v. 39, n. 5, с. 977-983, 2010.

SILVA, T. S. C. et al. Fitase líquida em Dieta extrusada para juvenis de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus).Acta Sciencia Animal Sciences, Maringá, v. 29, n. 4, с. 449-455, 2007.

ТАНИГУТИ А.Ю.; ТАКАНО, К. Очистка и свойства B-галактозидазы из кишечника тиляпии: пищеварительный фермент для тиляпии-X. Наука о рыболовстве, Токио, т. 70, н. 4, с. 688-694, 2004.

УЭНОХО, М.; Пасторе, Г. М. Пектинолитические ферменты. Промышленное применение и перспективы на будущее. Química Nova, Сан-Паулу, т. 30, н. 2, с. 388-394, 2007.

ВАН СОЭСТ, П.Дж.; РОБЕРТСОН, Дж. Б.; ЛЬЮИС, Б.A. Методы определения пищевой клетчатки, нейтрально-детергентной клетчатки и некрахмальных полисахаридов в связи с кормлением животных. Journal of Dairy Science, Champaign, т. 74, н. 10, с. 3583-3597, 1991.

ВЬЕЙ, К.; Зейкус, Дж. Термоферменты: определение молекулярных детерминант структурной и функциональной стабильности белка. Тенденции в биотехнологии, Бостон, т. 14, н. 1, с. 183-190, 1996.

Примечания

1 Выдержки из магистерской диссертации первого автора.

Примечания автора

* Автор, ответственный за переписку: [email protected]ком.

NiLe Tilapia Fed ферментный комплекс, добавляемый на разных уровнях и этапах обработки 1 Нил-тилапии Фериновый комплекс фермента, добавляемый на разных уровнях и этапах обработки

Ниль-тилапии Федеральный ферментный комплекс, добавляемый на разных уровнях и шагах обработки

М. Г. Мартинс и др. Et al.

Rev. Caatinga, Mossoró, v. 31, n. 1, с. 171 – 179, янв. – март 2018 г. 178

Pleurotus ostreatus для использования в качестве нетрадиционного корма

в рационах Oreochromis niloticus.African

Журнал микробиологических исследований, Лагос, т. 5, н.

19, с. 3038-3050, 2011.

BIAZUS, J.P.M. et al. Caracterização da atividade

amilásica do malte de milho (Zea mays). Acta

Scientiarum: Technology, Maringá, v. 28, n. 1, с.

13-19, 2006 г.

КАМПЕСТРИНИ, Э.; СИЛЬВА, В. Т. М.; APPET, M.

D. Utilização de enzimas na alimentação animal.

Revista Eletrônica Nutritime, Viçosa, v.2, н. 6, с.

254-267, 2005.

CARAWAY, W. T. Стабильный крахмальный субстрат для

определения амилазы в сыворотке и других жидкостях организма

. Американский журнал клинической патологии,

Оксфорд, т. 32, н. 1, с. 97-99, 1959.

КАРЛСОН, Д.; POULSEN, H. D. Фитат

разложение в пропитанных и ферментированных жидких кормах-

влияние рациона, время замачивания, термическая обработка,

фитазная активность, pH и температура.Корм для животных

Наука и технологии, Мадрид, т. 103, н. 1-4, с.

141-154, 2003.

CHAUYNARONG, N. et al. Влияние добавки экзогенных микробных ферментов

на потребление

корма, рост тела и развитие

фолликулов молодок перед яйцекладкой на кукурузно-соевом рационе.

International Journal of Poultry Science,

Champaign, т. 7, н. 3, с. 257-262, 2008.

ЧЭН, З.Дж.; Харди, Р. В. Влияние микробной

фитазы на кажущуюся усвояемость питательных веществ ячменем,

рапсовой мукой, пшеницей и проростками пшеницы, измерено

in vivo с использованием радужной форели (Oncorhynchusmykiss).

Aquaculture Nutrition, Порту, д. 8, н. 4, с. 271-277,

2002.

ЭЛЬ-САЙЕД, А.Б.М. Культура тилапии. 1. изд.

Александрия: CABI, 2006. 277 с.

ESMAEILIPOUR, O. et al. Влияние температуры,

pH, времени инкубации и концентрации пепсина на

in vitro стабильность внутренней фитазы пшеницы

ячменя и ржи.Animal Feed Science and

Technology, Madrid, v. 175, n. 3-4, с. 168–174,

2012.

GIONGO, J. L. Характеристика и применение

протеаз, производящих линхагены Bacillus

sp.. 2006. 95 f. Dissertação (Mestrado em

Agroquímica: Área de concentração em

Microbiologia Agrícola e do Meio-Ambiente) —

Федеральный университет Риу-Гранди-ду-Сул, Порту

Алегри, 2006.

ГОМЕС, Э. и др. Enzimas termoestáveis: шрифты,

производство и промышленное применение. Química Nova, São

Paulo, v. 30, n. 1, с. 136-145, 2007.

ДЖЕГАННАТАН, К.Р.; NIELSEN, P. H.

Экологическая оценка использования ферментов в промышленном производстве

– обзор литературы. Журнал

Чистого производства, Амстердам, т. 42, н. 10, с.

228–240, 2013.

KUBITZA, F. Tilápia: technologia e planejamento na

produção коммерческий.1. изд. Jundiaí, SP: Edição do

автора, 2000. 285 стр.

МОУРА, Г. С. и др. Desempenho e atividade де

амилаза em tilápias-ду-нило submetidas различных

температуры. Pesquisa Agropecuária Brasileira,

Brasília, v. 42, n. 11, с. 1609-1615, 2007.

MILLER, G.L. Использование реагента динитросалициловой кислоты

для определения восстанавливающего сахара. Analytical

Chemistry, Washington, v.31, н. 3, с. 426-428,

1956.

НЕЛЬСОН, Д. Л.; COX, M. Princípios de

bioquimica de Lehninger. 6. изд. Порту-Алегри, RS:

ARTMED, 2014. 1328 стр.

ОЛИВА-ТЕЛЕС, А. и др. Использование рационов

с добавлением микробной фитазы молодью морского окуня

(Dicentrarchus labrax). Водная жизнь

Ресурсы, Кембридж, т. 11, н. 4, с. 255-259, 1998.

PASSOS, S.R. et al.Enzimática Atividade e perfil da

comunidade бактериальный em одиночный submetido à

Solarização e biofumigação. Pesquisa agropecuária

brasileira, Brasília, v. 43, n. 7, с. 879-885, 2008.

REIS, T.A.F.C. et al. Avaliação do potencial

biotechnológico de xilanases do Clostridum termo

Cellum e Cellvibriomixtus: sua utilização na

Supplementação de Dietas à base de trigo para frango

de corte.Revista Portuguesa de Ciências

Veterinárias, Lisboa, v. 96, n. 539, с. 125-134,

2001.

ROCHA, B.C. et al. Suplementação de fitase

microbiana na Dieta de alevinos de jundiá: efeito

sobre o desempenho produtivo e as características de

carcaça. Ciência Rural, Санта-Мария, д. 37, н. 6, с.

1772-1778, 2007.

SIGNOR, A. A. et al. Desempenho de juvenis de

tilápia-do-nilo alimentados com rações contendo

complexo enzimático.Revista Brasileira

Zootecnia, Viçosa, v. 39, n. 5, с. 977-983, 2010.

SILVA, T.S.C. et al. Fitase líquida em dieta

extrusada para juvenis de tilapia do Nilo

(Oreochromis niloticus). Acta Sciencia Animal

Sciences, Maringá, v. 29, n. 4, с. 449-455, 2007.

регулируемый флуоресцентный секреторный груз для различных модельных организмов

Abstract

Мембранный трафик можно изучать путем визуализации грузового белка, когда он проходит секреторный путь.Лучшие инструменты для этой цели сначала блокируют экспорт секреторного груза из эндоплазматического ретикулума (ЭР), а затем освобождают блок для создания волны груза. Однако ранее разработанные регулируемые секреторные грузы часто сложно использовать или они специфичны для одного модельного организма. Чтобы преодолеть эти препятствия для почкующихся дрожжей, мы недавно оптимизировали искусственный флуоресцентный секреторный белок, который выходит из ER с помощью грузового рецептора Erv29, который гомологичен Surf4 млекопитающих.Флуоресцентный секреторный белок образует агрегаты в просвете ЭР и может быть быстро дезагрегирован добавлением лиганда для создания почти синхронизированной волны груза. Здесь мы называем этот регулируемый секреторный белок ESCargo (Erv29/Surf4-зависимый секреторный груз) и демонстрируем его полезность не только в клетках дрожжей, но также и в культивируемых клетках млекопитающих, клетках Drosophila и инфузориях Tetrahymena thermophila . Кинетические исследования показывают, что для быстрого экспорта из ER требуется распознавание Erv29/Surf4.Выбрав соответствующую сигнальную последовательность ER и вектор экспрессии, эту простую технологию, вероятно, можно использовать со многими модельными организмами.

ВВЕДЕНИЕ

Наши знания о секреторном пути прогрессивно расширились от морфологических наблюдений до изучения лежащего в их основе молекулярного механизма. Большинство ключевых игроков идентифицировано, и они охарактеризованы на биохимическом и структурном уровнях. Тем не менее, остаются фундаментальные вопросы о том, как эти компоненты работают вместе, чтобы управлять мембранным трафиком.В этом отношении мощным методом является отслеживание секреторных грузов в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии (Lippincott-Schwartz et al. , 2000). Естественный или искусственный секреторный груз обычно метят флуоресцентным белком. Оптимальный подход состоит в том, чтобы сначала улавливать секреторный груз в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) по двум причинам. Во-первых, период пребывания в ER дает флуоресцентной белковой части груза время для приобретения зрелого хромофора. Во-вторых, когда накопленный груз высвобождается для экспорта ER, возникающая в результате волна транспорта освещает этапы движения груза по секреторному пути (Trucco et al., 2004; Boncompain и Perez, 2013 г.).

Несколько регулируемых секреторных грузов были созданы для клеток млекопитающих. Меченые версии термочувствительного мутанта tsO45 вирусного гликопротеина VSV-G накапливаются в ЭР при 40°C и могут высвобождаться для экспорта в ЭР при понижении температуры до 32°C (Presley et al. , 1997; Scales et и др. , 1997). Точно так же проколлаген накапливается в ЭР при 40°C и может быть высвобожден для экспорта в ЭР при снижении температуры и добавлении аскорбиновой кислоты (Миронов и соавт., 2001). Эти регулируемые секреторные грузы вряд ли подходят для других модельных организмов. Более новый подход заключается в слиянии нескольких копий димерного растительного фоторецепторного белка UVR8 с секреторным грузом для создания локализованных в ЭР агрегатов, которые можно растворить импульсом УФ-света, чтобы вызвать экспорт ЭР (Chen et al. , 2013). . Возможно, наиболее популярным из недавно разработанных методов является удержание с использованием стрептавидиновых «крючков» (RUSH) (Boncompain et al. , 2012; Boncompain and Perez, 2013; Chen et al., 2017). Стрептавидин слит с резидентным белком ER и улавливает секреторный груз, помеченный стрептавидин-связывающим пептидом (SBP). Добавление биотина в среду ингибирует взаимодействие стрептавидин-SBP и высвобождает секреторный груз для экспорта ER. RUSH имеет большое преимущество в том, что он совместим с различными природными секреторными грузами.

Для дрожжевых клеток экспорт ER можно обратимо заблокировать с помощью термочувствительных мутантов. Этот подход был использован для отслеживания перемещения меченой версии трансмембранного белка Axl2 к аппарату Гольджи и через него (Kurokawa et al., 2014, 2019). Возможным альтернативным методом для дрожжей является RUSH, но первоначальный захват в ER требует низкой концентрации биотина, и в наших руках это ограничение не позволило использовать RUSH с дрожжами (неопубликованные данные). Аналогичные проблемы могут возникнуть при применении RUSH к другим модельным организмам.

Универсальный регулируемый секреторный груз был описан Rivera et al. (2000) . Они объединили зеленый флуоресцентный белок (GFP) с четырьмя копиями обратимо димеризующегося мутанта F36M FK506-связывающего белка (FKBP).Когда эта конструкция была нацелена на ER, димеризация доменов FKBP создавала агрегаты, которые можно было растворить путем добавления лиганда, препятствующего димеризации FKBP. Мы адаптировали этот подход для дрожжей с модификациями. Улучшенные варианты FKBP с мутациями F36L и I90V демонстрируют повышенную аффинность к лигандам и более быструю дезагрегацию (Barrero et al. , 2016). Когда единственная копия такого варианта FKBP, названная FKBP RD (C22V), была слита с хорошо растворимым тетрамерным флуоресцентным белком DsRed-Express2 (Strack et al., 2008), результатом были красные флуоресцентные агрегаты, которые легко растворялись при добавлении SLF, синтетического лиганда FKBP () (Holt et al. , 1993; Barrero et al. , 2016; Casler et al. , 2019). Нацеливание этой конструкции на просвет ER генерировало флуоресцентные агрегаты, не вызывая обнаруживаемого клеточного стресса, а добавление SLF растворяло агрегаты с образованием растворимых тетрамеров, которые выходили из ER (Casler et al. , 2019).

ESCargo как инструмент для контроля секреции в S.cerevisiae . (A) Стратегия создания и растворения флуоресцентных агрегатов. Тетрамеры DsRed-Express2 (красные), слитые с димерным вариантом FKBP (золото), связываются с образованием агрегатов. Добавление лиганда FKBP SLF (синий) блокирует димеризацию, тем самым растворяя агрегаты в растворимые тетрамеры. (B) Функциональные сегменты конструкции ESCargo. pOst1 (зеленый): сигнальная последовательность ER, которая управляет котрансляционной транслокацией у дрожжей. APVNTT (розовый): сигнал экспорта трипептида ER, за которым следует сигнал N-связанного гликозилирования трипептида.DsRed-Express2 (красный): тетрамерный красный флуоресцентный белок. Димерный FKBP (золото): обратимо димеризующийся вариант FKBP RD (C22V). Длины сегментов указаны не в масштабе. (C) Секреция ESCargo в дрожжевых клетках, содержащих или не содержащих Erv29. Штаммы ERV29 дикого типа и erv29 Δ, экспрессирующие ESCargo, выращивали в течение ночи до середины логарифмической фазы, а затем визуализировали с помощью конфокальной и светлопольной микроскопии. SLF добавляли в нулевое время до конечной концентрации 100 мкМ. Средние прогнозируемые Z-стеки взяты из дополнительного фильма S1.Масштабная линейка, 2 мкм. (D) Количественная оценка внутриклеточной флуоресценции ESCargo клеток в C. В каждый момент времени светлопольное изображение использовалось для выбора профиля клеток и количественной оценки общей флуоресценции ESCargo. Каждый след флуоресценции нормализовали к среднему значению трех самых высоких сигналов флуоресценции в этом следе. (E) Средняя внутриклеточная флуоресценция ESCargo. Для каждого из двух штаммов измеряли сигналы не менее чем от восьми клеток из трех фильмов и усредняли нормированные, как в D, кривые.Диапазоны ошибок представляют SEM. (F) Обнаружение секреции ESCargo в среду с помощью иммуноблоттинга. Штаммы, изображенные на C, выращивали в течение ночи в богатой среде, а затем промывали и ресуспендировали в свежей среде до той же оптической плотности. Затем добавляли SLF до конечной концентрации 100 мкМ для растворения агрегатов ESCargo. Через указанное время секретированный ESCargo осаждали из культуральной среды, подвергали обработке эндогликозидазой Н для обрезки гликанов N и анализировали с помощью иммуноблоттинга с антителом против FKBP.Показан репрезентативный результат. Основываясь на эталонных маркерах, обнаруженная полоса имела кажущуюся молекулярную массу ~37 кДа, что близко к предсказанной молекулярной массе 38,3 кДа.

Фильм S1

Фильм S1

ESCargo in Saccharomyces cerevisiae . Показаны репрезентативные клетки штамма дикого типа (WT), содержащего Erv29, и штамма erv29 Δ. Конфокальные Z-стеки регистрировались каждые 15 с в течение 24,5 мин. SLF добавляли в нулевое время до конечной концентрации 100 мкМ.Кадры фильма представляют собой усредненные проецируемые сигналы флуоресценции, объединенные с изображениями клеток в светлом поле. Изображения из этого фильма показаны на рисунке 1C. Масштабная линейка, 2 мкм.

ER экспорт секреторного груза DsRed-Express2-FKBP RD (C22V) должен был происходить при относительно низкой скорости объемного потока (Barlowe and Helenius, 2016). Решающим усовершенствованием было слияние трипептида APV с N-концом зрелого секреторного груза. Этот трипептид распознается грузовым рецептором Erv29 и обеспечивает быстрый транспорт от ER к аппарату Гольджи (Barlowe and Helenius, 2016; Yin et al., 2018). Окончательный слитый белок состоял из расщепляемой сигнальной последовательности ER, которая запускала котрансляционную транслокацию в просвет ER, за которой следовал APV, за которым следовал трипептид N -сигнал гликозилирования NTT, за которым следовал DsRed-Express2, за которым следовал FKBP RD (C22V ) () (Каслер и Глик, 2019 г.). Здесь мы обозначаем зрелый слитый белок «ESCargo» для Erv29-зависимого секреторного груза. Добавление SLF вызвало волну флуоресцентного ESCargo, который можно было отследить в созревающих цистернах Гольджи (Casler et al., 2019). Впоследствии этот подход был расширен путем добавления С-концевого вакуолярного нацеливающего пептида к ESCargo, что позволило провести кинетический анализ биосинтетического трафика в дрожжевой вакуоли (Casler and Glick, 2020).

Мы предполагали, что исходная секретируемая версия ESCargo может быть использована в других типах клеток. В частности, клетки млекопитающих содержат связанный с Erv29 экспортный рецептор ER, называемый Surf4, который распознает трипептидные сигналы того же типа (Mitrovic et al. , 2008; Yin et al., 2018). Чтобы адаптировать ESCargo для использования в данном организме, необходимо добавить соответствующую сигнальную последовательность ER, а затем экспрессировать эту конструкцию с использованием подходящего вектора. Сравнивая ESCargo с версией, в которой отсутствует трипептид, распознаваемый Erv29/Surf4, можно измерить кинетику экспорта ER объемного потока по сравнению с экспортом ER, зависящим от сигнала (Casler et al. , 2019). Теперь мы документируем широкую полезность ESCargo в качестве регулируемого флуоресцентного секреторного груза.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ESCargo подвергается сигнал-зависимому экспорту ER в дрожжах

ESCargo был разработан для отслеживания секреции в дрожжах (Casler and Glick, 2019; Casler et al., 2019). Этот белок был нацелен на ER с помощью сигнальной последовательности Ost1, которая управляет котрансляционной транслокацией (Willer et al. , 2008; Fitzgerald and Glick, 2014), тем самым обеспечивая образование флуоресцентных агрегатов в просвете ER.

Для настоящего анализа мы использовали модифицированный анализ, чтобы убедиться, что Erv29 ускоряет экспорт дезагрегированного ESCargo в ЭР (Casler et al. , 2019). Вместо измерения потери ESCargo, связанного с ER, путем получения статических изображений после добавления SLF (Casler et al., 2019), мы отслеживали суммарные сигналы флуоресценции в отдельных клетках с помощью четырехмерной конфокальной микроскопии, а затем усредняли полученные следы. Хотя вектор экспрессии был интегрирован в геном в виде единственной копии, количество агрегированного ESCargo в ER варьировалось от клетки к клетке, и мы пришли к выводу, что высокие уровни ESCargo будут насыщать систему экспорта ER. Действительно, ячейки, которые содержали большое количество ESCargo, показали более медленную кинетику грузопотока (неопубликованные данные).Поэтому эксперимент был сосредоточен на клетках, которые изначально содержали умеренное количество агрегированного ESCargo. Около 75% клеток относились к этой категории.

Количественную оценку проводили параллельно с использованием штаммов ERV29 дикого типа и erv29 Δ (и дополнительного фильма S1). После добавления SLF этот препарат должен был постоянно присутствовать внутри клеток, чтобы предотвратить реагрегацию. Клетки дрожжей имеют плейотропные переносчики лекарств, поэтому штаммы несут делеции PDR1 и PDR3 , которые кодируют факторы транскрипции, управляющие экспрессией нескольких переносчиков лекарств (Schüller et al., 2007; Кури и др. , 2015; Барреро и др. , 2016). Штаммы также несли аллель vps10-104 , который предотвращает попадание флуоресцентных белков в вакуоль гомологом сортилина Vps10 (Fitzgerald and Glick, 2014; Casler et al. , 2019). После добавления SLF в нулевое время агрегаты ESCargo растворялись. В типичной клетке ERV29 красная флуоресценция значительно уменьшалась через 10 минут и не обнаруживалась через 20 минут (10).Напротив, в типичной клетке erv29 Δ красная флуоресценция сохранялась в ER в течение всего времени (10).

показаны сигналы флуоресценции, усредненные для нескольких клеток из каждого штамма. Для штамма ERV29 уровни ESCargo начали снижаться вскоре после добавления SLF. Этот эффект отражает быстрый экспорт ER с последующим транспортом через аппарат Гольджи к плазматической мембране (Casler et al. , 2019). Для штамма erv29 Δ сигнал снижался гораздо более плавно.Предположительно, экспорт ЭР у этого штамма происходил при низкой скорости объемного потока. В поддержку этой интерпретации иммуноблот ESCargo в культуральной среде подтвердил, что секреция была быстрой для штамма ERV29 , но намного медленнее для штамма erv29 Δ (1). Таким образом, ESCargo подвергается зависимому от сигнала экспорту ER, опосредованному Erv29 в штамме дикого типа, или экспорту ER объемного потока в штамме erv29 Δ.

ESCargo подвергается зависимому от сигнала экспорту ER в культивируемых клетках млекопитающих

Чтобы экспрессировать ESCargo в клетках млекопитающих и нацеливать его на ER, мы субклонировали генную кассету ESCargo в вектор, содержащий промотор EF-1α, за которым следует сигнал тяжелой цепи иммуноглобулина последовательность (Strack et al., 2009b). В контрольном варианте ESCargo отсутствовали как сигнал экспорта трипептида ER, так и сигнал N-гликозилирования трипептида. Этот контрольный вариант, названный здесь ESCargo* (), не имеет известных сигналов для экспорта ER и, следовательно, ожидалось, что он будет секреторным грузом объемного потока. Обе конструкции трансфицировали в клеточную линию Flp-In 293 T-REx, которая стабильно экспрессировала маркер Гольджи N -ацетилгалактозаминилтрансферазу 2 (GalNAc-T2)-GFP для мечения околоядерной ленты Гольджи (Storrie et al., 1998).

Трафик вариантов ESCargo в культивируемых клетках млекопитающих. (A) Функциональные сегменты конструкций ESCargo(FTV) и ESCargo*. pIgH (зеленый): сигнальная последовательность ER млекопитающих. FTVNTT (розовый): сигнал экспорта трипептида ER, за которым следует сигнал N-связанного гликозилирования трипептида. Для получения дополнительной информации см. (B) Сравнение варианта ESCargo* с объемным потоком и ESCargo, содержащего сигнал (FTV). Клетки Flp-In 293 T-REx, стабильно экспрессирующие маркер Гольджи GalNAc-T2-GFP, выращивали на конфокальных чашках и трансфицировали экспрессионными конструкциями для ESCargo* (вверху) или ESCargo(FTV) (внизу) за 24–48 ч до конфокальной визуализации.После обработки циклогексимидом в нулевое время добавляли SLF до конечной концентрации 50 мкМ. Для каждого варианта груза верхняя строка показывает объединенные изображения, а две другие строки показывают красный и зеленый каналы. Средние прогнозируемые Z-стеки были взяты из первой части дополнительного фильма S2. Масштабная линейка, 5 мкм. (C) Количественная оценка связанной с Гольджи флуоресценции груза для клеток в B. Сигнал GalNAc-T2-GFP использовался для создания масок для количественной оценки связанной с Гольджи флуоресценции в грузовом канале.(D) Количественная оценка была выполнена, как в C, для создания усредненных временных курсов с использованием не менее семи ячеек из шести фильмов для каждого варианта. Диапазоны ошибок представляют SEM.

Когда клетки экспрессировали ESCargo*, почти все они накапливали ярко-красные флуоресцентные круглые агрегаты, которые растворялись при добавлении SLF, заполняя ER. Репрезентативная ячейка показана в дополнительном фильме S2 с количественными данными в . В этой клетке флуоресценция ESCargo* начинала появляться в аппарате Гольджи через 10 мин после добавления СЛФ и к 20 мин достигала уровня плато в аппарате Гольджи ~20–25% от общей исходной флуоресценции.Грузовой сигнал в Гольджи оставался примерно на одном уровне не менее 60 мин. Между тем, значительный сигнал груза оставался в ER в течение всего времени. Клетки обрабатывали циклогексимидом для подавления синтеза нового белка, поэтому постоянный сигнал ER, по-видимому, был связан с медленным экспортом ER. Эти результаты были типичны для клеток популяции, на что указывают усредненные данные в . Таким образом, ESCargo* действует, как и ожидалось, для секретного груза объемного потока.

Movie S2

Movie S2

ESCargo* и ESCargo(FTV) в культивируемых клетках млекопитающих и ESCargo(FTV) в нейронах коры головного мозга крыс.В первой части фильма клетки Flp-In 293 T-REx, стабильно экспрессирующие маркер Гольджи GalNAc-T2-GFP, выращивали на конфокальных чашках и трансфицировали конструкциями для экспрессии ESCargo* (слева) или ESCargo(FTV) (справа). 24-48 ч до визуализации. После обработки циклогексимидом в нулевое время добавляли SLF до конечной концентрации 50 мкМ. Конфокальные Z-стеки снимались каждые 30 с в течение 62 мин. Средние прогнозы показаны для репрезентативных ячеек. Верхняя панель представляет собой слияние двух каналов флуоресценции.Изображения из этого фильма показаны на рисунке 2B. Масштабная линейка, 5 мкм. Во второй части фильма нейроны коры головного мозга крыс трансфицировали для экспрессии маркера Гольджи ManII-GFP вместе с ESCargo(FTV) за 48 ч до визуализации. На левой и правой панелях показаны отдельные фильмы двух репрезентативных клеток. Конфокальные Z-стеки снимали за 2 мин до добавления SLF, а затем каждые 2 мин после добавления SLF в течение 100 мин (левая панель) или 60 мин (правая панель). Изображения из этого фильма показаны на рис. 3, A и B. Масштабная линейка, 10 мкм.

Когда клетки вместо этого экспрессировали ESCargo, содержащий трипептид APV, наблюдалась точечная красная флуоресценция, но для большинства клеток картина флуоресценции мало менялась при добавлении SLF (неопубликованные данные). Этот эффект подчеркивает ограничение ESCargo: как ранее было задокументировано для дрожжевых клеток, существует кинетическая конкуренция между агрегацией в ER и сигнал-зависимым экспортом ER (Casler et al. , 2019; Casler and Glick, 2020). В клетках млекопитающих экспорт ER имеет тенденцию побеждать в гонке, и большая часть ESCargo накапливается в пост-ER компартментах.Эта проблема была преодолена за счет использования менее мощного сигнала экспорта ER (Yin et al. , 2018). Трипептид FTV (1) дал удовлетворительные результаты: почти все клетки демонстрировали флуоресцентные агрегаты, которые растворялись при добавлении SLF для заполнения ER (и дополнительный фильм S2). Поэтому мы использовали FTV-вариант ESCargo, названный здесь ESCargo(FTV), для дальнейших экспериментов с клетками млекопитающих.

После добавления SLF ESCargo(FTV) быстро выходил из ER и накапливался в аппарате Гольджи, при этом около 80% от общей начальной флуоресценции в аппарате Гольджи через 20 минут после добавления SLF (и дополнительный фильм S2).Затем флуоресценция ESCargo(FTV) в аппарате Гольджи постепенно снижалась. Начиная примерно через 25 минут после добавления SLF, небольшие подвижные структуры, содержащие ESCargo(FTV), были видны вблизи Гольджи. Эти структуры предположительно были секреторными носителями (Hirschberg et al. , 1998; Toomre et al. , 1999; Полищук et al. , 2000). В 60-минутный момент времени большая часть флуоресценции ESCargo (FTV) покинула клетки, хотя некоторый сигнал остался в Гольджи (и дополнительный фильм S2).Объединенные результаты показывают, что ESCargo(FTV) проходит секреторный путь млекопитающих способом, который включает рецептор-зависимый экспорт ER.

Сложным типом клеток для визуализации секреторного транспорта грузов являются нейроны, поскольку дендриты содержат изолированные «аванпосты Гольджи» (рассмотрено в Valenzuela et al. , 2020). Эти аванпосты могут возникать в результате деления канальцев, которые отходят от соматического аппарата Гольджи в дендриты (Quassollo et al. , 2015) (и дополнительный фильм S2).Мы использовали маннозидазу II (ManII)-GFP для маркировки как соматических Гольджи, так и аванпостов Гольджи в культивируемых нейронах коры головного мозга крысы (14). Когда ESCargo(FTV) также экспрессировался в этих клетках, сферические агрегаты присутствовали как в соме, так и в дендритах (4). В течение 10 минут после добавления SLF ESCargo (FTV) был виден в соматическом аппарате Гольджи и во всех дендритных аванпостах Гольджи (и дополнительный фильм S2). Таким образом, ESCargo(FTV) подходит для характеристики секреторной активности нейрональных структур Гольджи.

Трафик ESCargo(FTV) в нейронах коры головного мозга крыс. Изолированные нейроны культивировали в течение 15 дней in vitro и трансфицировали конструкциями, кодирующими ManII-GFP и ESCargo(FTV) за 48 часов до визуализации. SLF добавляли в нулевое время до конечной концентрации 50 мкМ. Для каждой из двух репрезентативных ячеек в верхней строке показаны объединенные изображения, а в двух других строках — красный и зеленый каналы. Средние прогнозируемые Z-стеки были взяты из второй части дополнительного фильма S2. (A) Пример нейрона с длинным трубчатым расширением от соматического аппарата Гольджи до дендрита.Первоначально были видны два аванпоста Гольджи, и трубочка постепенно фрагментировалась, создавая дополнительные аванпосты Гольджи. Масштабная линейка, 10 мкм. (B) Пример нейрона, который изначально содержал несколько точечных аванпостов Гольджи. Масштабная линейка, 10 мкм. (C) Количественная оценка флуоресценции груза, связанной с аванпостом Гольджи, в клетках в A и B. Сигнал ManII-GFP использовался для создания масок для количественной оценки флуоресценции, связанной с аванпостом Гольджи, в грузовом канале.

ESCargo подвергается зависимому от сигнала экспорту ER в клетках

Drosophila ЭСКарго.Эти две конструкции были экспрессированы в клетках Drosophila S2 вместе с маркером Гольджи ManII-GFP, который метил несколько отдельных стопок Гольджи (Zhou et al. , 2014).

Как ESCargo*, так и ESCargo образовывали красные флуоресцентные круглые агрегаты, которые быстро растворялись при добавлении SLF (и дополнительный фильм S3). Практически все клетки в популяции продемонстрировали сходные ответы. ESCargo* был виден в ER в течение всего времени, а также постоянно виден в аппарате Гольджи, начиная с 5–10 мин.Напротив, ESCargo показал только очень временное распределение по всему ER, а затем полностью переместился в Golgi в ​​течение 2 минут (и дополнительный фильм S3). Большинство структур, меченных ManII-GFP, приобретали флуоресценцию ESCargo. Остальные структуры, меченные ManII-GFP, вероятно, не были стопками Гольджи, потому что отдельные эксперименты с тройной меткой (дополнительная фигура S1A) показали, что некоторые структуры, меченные ManII-GFP, были удалены от маркера сайта выхода ER Tango1 и маркера Golgi GM130 (Liu и др., 2017). Действительно, когда GM130 использовался в качестве маркера Гольджи, все стеки Гольджи показали накопление груза (дополнительный рисунок S1B). Начиная примерно через 10 минут после добавления SLF, ESCargo начал отходить от стеков Гольджи в небольших мобильных носителях, а к 20 минутам клеточная флуоресценция ESCargo почти полностью исчезла (и дополнительный фильм S3). Эти результаты показывают, что ESCargo выходит из Drosophila ER сигнал-зависимым образом и затем быстро пересекает секреторный путь.

Перевозка вариантов ESCargo в Drosophila melanogaster . (A) Сравнение варианта ESCargo* объемного потока с содержащим сигнал ESCargo в клетках Drosophila S2. Клетки трансфицировали Ubi-GAL4, pUASt-ManII-eGFP и либо pUASt-ssBiP-ESCargo* (вверху), либо pUASt-ssBiP-ESCargo (внизу). Через 3–4 дня клетки прикрепляли к чашкам, покрытым ConA, на 30 мин перед конфокальной визуализацией. SLF добавляли в нулевое время до конечной концентрации 50 мкМ. Для каждого варианта груза верхняя строка показывает объединенные изображения, а две другие строки показывают красный и зеленый каналы.Средние прогнозируемые Z-стеки были взяты из дополнительного фильма S3. Масштабная линейка, 5 мкм. (B) Количественная оценка связанной с Гольджи флуоресценции груза для клеток в A. Сигнал ManII-GFP использовался для создания масок для количественной оценки связанной с Гольджи флуоресценции в грузовом канале. (C) Колокализация ESCargo с Golgi в ​​фолликулярных эпителиальных клетках яйцевой камеры Drosophila . Яйцевые камеры линии Drosophila (w; traffic jam-Gal4/+; UASt-ssBiP-ESCargo/UASp-YFP-Rab10), экспрессирующей ESCargo и YFP-Rab10, фиксировали до и через 5 мин после введения 50 мкМ SLF.Показаны средние проекции центральных четырех срезов из конфокальных Z-стеков. В верхней строке показаны объединенные изображения, а в двух других строках — красный и зеленый каналы. Масштабная линейка, 5 мкм.

Movie S3

Movie S3

ESCargo* и ESCargo в клетках Drosophila S2. Клетки трансфицировали Ubi-GAL4, pUASt-ManII-eGFP и либо pUASt-ssBiP-ESCargo* (слева), либо pUASt-ssBiP-ESCargo (справа). Через 3-4 дня клетки прикрепляли к конфокальным чашкам, покрытым ConA, на 30 минут перед конфокальной визуализацией.SLF добавляли в нулевое время до конечной концентрации 50 мкМ. Конфокальные Z-стеки снимались каждые 30 с в течение 54,5 мин. Средние прогнозы показаны для репрезентативных ячеек. Верхняя панель представляет собой слияние двух каналов флуоресценции. Изображения из этого фильма показаны на рисунке 4A. Масштабная линейка, 5 мксм.

Дрозофила также предоставила возможность проверить, можно ли использовать ESCargo в многоклеточном организме. Мы создали линию Drosophila , в которой конструкция ESCargo, нацеленная на ER, была встроена в хромосому 3R.Экспрессия в фолликулярных эпителиальных клетках яйцевой камеры приводит к образованию крупных красных флуоресцентных агрегатов (11). После инкубации с SLF в течение 5 минут большая часть красной флуоресценции перераспределялась в области, отмеченные YFP-Rab10, которые концентрируются возле стопок Гольджи () (Lerner et al. , 2013). Этот результат предполагает, что ESCargo ведет себя одинаково в культивируемых клетках и в интактной ткани.

ESCargo* подвергается регулируемой секреции у

Tetrahymena thermophila

Наш анализ был ограничен опистоконтами, которые тесно связаны с эволюционной точки зрения.Поэтому мы обратились к эволюционно далекой инфузории T. thermophila . В дополнение к своим специализированным органеллам Tetrahymena содержит органеллы стандартного секреторного пути, включая ER и Гольджи, и этот модельный организм широко использовался для изучения мембранного трафика (Nusblat et al. , 2012).

Для транслокации в Tetrahymena ER мы использовали сигнальную последовательность белка слизистой оболочки Grl1 (Chilcoat et al. , 1996).Сайт расщепления этой сигнальной последовательности экспериментально не определен, поэтому не удалось создать конструкцию, в которой трипептид APV был бы надежно расположен на N-конце зрелого белка. Вместо этого сигнальная последовательность Grl1 была слита с ESCargo*. Эта конструкция экспрессировалась под контролем промотора, индуцируемого кадмием (Shang et al. , 2002).

Флуоресценция не наблюдалась до индукции кадмием (неопубликованные данные), но после индукции клетки содержали рассеянные точечные флуоресцентные структуры, которые предположительно представляли собой агрегаты, локализованные в ER ().Точки оставались стабильными не менее 1 часа (неопубликованные данные). После добавления SLF точки исчезали, а клетки демонстрировали рассеянную флуоресценцию по ER-подобному образцу в течение 30-минутного периода времени (1). К 30 мин вернулась некоторая точечная флуоресценция (), возможно, из-за реагрегации, вызванной экструзией или деградацией SLF. Эти эффекты наблюдались, по крайней мере, в 90% клеток, что было визуализировано с помощью флуоресцентной микроскопии. В течение 5 минут после добавления SLF секретируемый белок можно было обнаружить в среде с помощью иммуноблоттинга (4).Полный анализ будет включать эксперименты, выходящие за рамки этого исследования, включая идентификацию сайта расщепления сигнальной последовательности, тестирование предполагаемых сигналов экспорта трипептида ER, тесты колокализации с маркерами органелл и временной ход секреции. Однако имеющиеся результаты предполагают, что ESCargo* может секретироваться в Tetrahymena .

Движение ESCargo* в T. thermophila . (A) Конфокальные срезы фиксированных клеток Tetrahymena , экспрессирующих ESCargo*, нацеленный на ER, с парными дифференциально-интерференционно-контрастными изображениями.Экспрессию белка индуцировали CdCl 2 перед добавлением 12,5 мкМ SLF. На верхней панели показаны клетки, зафиксированные сразу после добавления SLF (0 мин), а на других панелях показаны клетки, зафиксированные после обработки SLF в течение 5, 15 или 30 мин. Время экспозиции флуоресценции составляло 100 мс для 0-минутного изображения или 400 мс для других изображений. Первоначально были видны яркие флуоресцентные точки, но они исчезли в течение 5 минут после добавления SLF, что привело к рассеянной флуоресценции в ER-подобных мембранах, которые включали ядерную оболочку.К 30 мин вновь появлялась точечная флуоресценция. Шкала баров, 10 мкм. (B) Иммуноблот-анализ секреции ESCargo*. Клетки Tetrahymena , экспрессирующие ESCargo*, обрабатывали 12,5 мкМ SLF в течение 5 мин. После центрифугирования осадок клеток, осажденный ТХУ, и образцы культуральной среды, не содержащей клеток, анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблотинга с антителом против FBKP. Грузовой белок был обнаружен в лизатах цельных клеток для индуцированных необработанных и индуцированных SLF-обработанных клеток и в среде только для индуцированных SLF-обработанных клеток.Грузовой белок не был обнаружен в неиндуцированных клетках. Показан репрезентативный результат.

Выводы

Наш анализ показывает, что ESCargo можно использовать в качестве регулируемого красного флуоресцентного секреторного груза в модельных организмах. Если желателен другой флуоресцентный цвет, часть груза DsRed-Express2 можно заменить вариантом DsRed-Express2, либо оранжевым E2-Orange (Strack et al. , 2009a), либо ярко-красным E2-Crimson. (Strack и др. , 2009b). Мы видели хорошие результаты с этими вариантами (неопубликованные данные).В клетках Saccharomyces cerevisiae , Drosophila и клетках млекопитающих SLF можно использовать для запуска быстрого растворения и Erv29/Surf4-зависимого экспорта ESCargo в ER. Неизвестно, имеют ли эволюционно отдаленные организмы, такие как растения, гомологи Erv29/Surf4, которые распознают сигналы экспорта трипептида ER. Однако первоначальные результаты с инфузориями T. thermophila позволяют предположить, что у широкого круга эукариот агрегаты ESCargo могут генерироваться в ER и затем растворяться с помощью SLF для запуска секреции.

Метод ESCargo имеет два ограничения. Во-первых, когда молекулы ESCargo, содержащие трипептид APV, попадают в ER, они испытывают кинетическую конкуренцию между агрегацией и сигнал-зависимым экспортом ER (Casler et al. , 2019; Casler and Glick, 2020). В результате значительная часть вновь синтезированных молекул ESCargo либо секретируется, либо доставляется в post-ER компартменты. Хотя это явление не мешало нашим исследованиям дрожжей, оно препятствовало эффективному захвату агрегатов ESCargo в клетках млекопитающих.Мы решили эту проблему, используя трипептид FTV, который является менее мощным сигналом экспорта ER (Yin et al. , 2018), который позволяет образовывать агрегаты, но при этом обеспечивает быстрый экспорт солюбилизированных тетрамеров ESCargo в ER. Другие сигналы экспорта трипептида ER могут быть оптимальными для разных организмов. Во-вторых, некоторые клетки эффективно экструдируют SLF, тем самым предотвращая полное и устойчивое растворение агрегатов ESCargo. Мы преодолели это препятствие для S. cerevisiae , заблокировав экспрессию плейотропных переносчиков лекарств (Barrero et al., 2016; Casler and Glick, 2019), но у почкующихся дрожжей Pichia pastoris нам не удалось солюбилизировать агрегаты ESCargo, локализованные в ER, с помощью SLF (неопубликованные данные). Возможно, лучшие результаты можно было бы получить с другими лигандами FKBP. В целом ESCargo подходит для клеток с ограниченными возможностями по экспорту наркотиков.

Наши данные показывают, что зависимый от сигнала экспорт ER может быть гораздо более эффективным, чем объемный поток. Предыдущее исследование пришло к выводу, что объемный поток был удивительно быстрым (Thor et al., 2009). Однако, как указывает Yin et al. (2018), секреторный груз, использованный в исследовании 2009 г., содержал метку гемагглютинина (YPYDVPDYA) непосредственно после сигнальной последовательности, а трипептид YPY распознается Surf4 как экспортный сигнал ER, поэтому секреция этого груза почти наверняка не происходят объемным потоком. Описанный здесь вариант ESCargo* лишен известных сигналов экспорта ER и должен быть хорошим выбором для измерения объемной секреции потока.

Мы полагаем, что ESCargo будет полезен для изучения работы секреторного пути.Данные подтверждают модель созревания цистерн для транспорта через Гольджи дрожжей (Casler et al. , 2019; Kurokawa et al. , 2019), но механизм трафика через Гольджи млекопитающих неоднозначен (Patterson et al. , 2008; Glick and Luini, 2011; Lavieu и др. , 2013; Rizzo и др. , 2013; Tie и др. , 2016; Dunlop 9 и др.). Согласно простой версии модели созревания, после того, как молекулы секреторного груза достигают аппарата Гольджи млекопитающих, они должны иметь лаг-период из-за прохождения через стек Гольджи, а затем должны удаляться с линейной кинетикой.Но в соответствии с моделью быстрого разделения после того, как молекулы секреторного груза прибывают в аппарат Гольджи, они должны немедленно начать выходить и удаляться с экспоненциальной кинетикой (Patterson et al. , 2008). В клетках млекопитающих ESCargo показал выраженный лаг-период в аппарате Гольджи перед появлением в секреторных переносчиках, как и предсказывает модель созревания, но некоторые молекулы ESCargo сохранялись в аппарате Гольджи в течение продолжительного времени, как предсказывает модель быстрого разделения. В клетках дрозофилы ESCargo показал лаг-период перед появлением в секреторных переносчиках, а затем вышел из Гольджи с близкой к линейной кинетикой, выполняя оба предсказания модели созревания.Эти наблюдения являются предварительными и потребуют тщательных последующих исследований, но они вселяют надежду на то, что новые инструменты помогут нарисовать единую картину секреторного пути.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Запросить протокол через Био-протокол.

Рост дрожжей, трансформация, микроскопия и иммуноблоттинг

Родительский гаплоидный штамм был JK9-3da ( leu2-3,112 ura3-52 rme1 trp1 his4 ) (Kunz et al. , 1993). Дрожжи выращивали при встряхивании в колбах с перегородками при 23°C в нефлуоресцентной среде NSD с минимальным выпадением глюкозы (Bevis et al., 2002) или в богатой глюкозой среде YPD с добавлением аденина и урацила. Введение мутации vps10-104 и делецию генов PDR1 и PDR3 проводили, как описано ранее (Casler and Glick, 2019). Белки секреторного груза экспрессировали с использованием интегрирующего вектора TRP1 с сильным конститутивным промотором TPI1 и терминатором CYC1 (Losev et al. , 2006). Для обеспечения одинаковой экспрессии между штаммами каждый клон был проверен на наличие одной копии интегрированной плазмиды с помощью ПЦР с использованием праймеров 5′-GTGTACTTTGCAGTTATGACG-3′ и 5′-AGTCAACCCCCTGCGATGTATATTTTCCTG-3′.

Для флуоресцентной микроскопии живых клеток штаммы дрожжей выращивали в NSD (pH ~4) при 23°C. Там, где указано, SLF разбавляли из 100 мМ исходного раствора в этаноле (Cayman Chemical; 10007974) до конечной концентрации 100 мкМ. Клетки прикрепляли к покрытой конканавалином А (КонА) чашке с покровным стеклом и дном, содержащей НСД (Лосев и др. , 2006), и визуализировали на конфокальном микроскопе Leica SP8, оснащенном объективом 1,4 NA/63×масло, используя 60 Размер пикселя –80 нм, интервал Z-шага 0,25–0,30 мкм и 20–30 оптических сечений.Фильмы были подвергнуты деконволюции с помощью Huygens Essential (Scientific Volume Imaging) с использованием классического алгоритма оценки максимального правдоподобия, затем преобразованы в гиперстеки и средние проекции, а затем скорректированы по диапазону для максимального контраста в ImageJ (Johnson and Glick, 2019).

Для иммуноблоттинга секретируемого ESCargo (Casler and Glick, 2020) каждую 10-мл дрожжевую культуру выращивали в YPD в течение ночи при встряхивании в колбе с перегородкой до OD 600 0,8. Клетки собирали коротким вращением в микроцентрифуге, дважды промывали свежим YPD и ресуспендировали в свежем YPD до той же OD 600 .Затем культуры обрабатывали 100 мкМ SLF. В каждый момент времени образец обрабатывали следующим образом. Отбирали аликвоту 1,6 мл и собирали клетки центрифугированием при 2500 х g (5000 об/мин) в течение 2 мин в микроцентрифуге. Супернатант культуральной среды переносили в свежую микроцентрифужную пробирку на льду и затем осаждали 4% трихлоруксусной кислотой (ТХУ) на льду в течение 20 мин. Осажденные белки центрифугировали на максимальной скорости в микроцентрифуге в течение 15 мин при 4°С. Наконец, каждый осадок белка ресуспендировали в 25 мкл буфера для образцов SDS-PAGE.Обработку эндогликозидазой Н проводили, как описано производителем (New England Biolabs; P0702S). Вкратце, к образцу белка добавляли буфер для денатурации гликопротеина, который кипятили в течение 5–10 минут, а затем добавляли GlycoBuffer 3 и эндогликозидазу Н. Инкубация проводилась при 37 ° C в течение не менее 1 часа. Затем 20 мкл каждого образца помещали на 4-20% трис-глициновый гель (Bio-Rad; 4561094). Разделенные белки переносили на поливинилидендифторидную мембрану (Bio-Rad; 1704156) с использованием системы Trans-Blot Turbo (Bio-Rad).Мембрану блокировали 5%-ным обезжиренным молоком в TBST (50 мМ Tris-HCl при pH 7,6, 150 мМ NaCl и 0,05% Tween 20) при встряхивании при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем инкубировали с 1:1000 поликлональными кроличьими антигенами. -Антитело FKBP12 (Abcam; ab2918) в 5% молоке/TBST при встряхивании в течение ночи при 4°C. После четырех 5-минутных промывок в TBST мембрану инкубировали с разведением 1:1000 козьего антикроличьего вторичного антитела, конъюгированного с Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher; A21245), в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем мембрану дважды промывали TBST и дважды 50 мМ Tris-HCl при pH 7.6, 150 мМ NaCl. Анализ проводился с помощью системы визуализации LI-COR Odyssey CLx.

Культура клеток млекопитающих, разработка и микроскопия «:»853117″,»term_text»:»R78007″}}R78007) содержались в 5% CO

2 при 37°C в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (GenClone; 25-550) и регулярно проверялись. для заражения микоплазмой с использованием набора для обнаружения микоплазмы (SouthernBiotech; 131001).Клетки трансфицировали 3 мкг ДНК с использованием FuGENE HD (Promega; E2311).

Для создания клеточной линии Flp-In 293 T-REx, стабильно экспрессирующей GalNAc-T2-GFP, синтетический gBlock (IDT), кодирующий оптимизированный по кодонам ген GalNAc-T2-GFP млекопитающих, сливали с геном msGFP2 (Valbuena et al. , 2020), и эту конструкцию встраивали в pcDNA5/FRT/TO (Thermo Fisher; V652020) для получения pcDNA5-GalNAc-T2-GFP. Эту плазмиду трансфицировали в клетки вместе с вектором экспрессии Flp-рекомбиназы pOG44 (Thermo Fisher; V600520).Через 2 дня в среду добавляли 200 мкг/мл гигромицина. В течение следующих 2 недель среду заменяли каждые несколько дней, пока на чашке не стали видны колонии. Отдельные клоны соскабливали на новую чашку и размножали. Успешная интеграция была подтверждена визуализацией флуоресценции GalNAc-T2-GFP во всех клетках, вновь приобретенной чувствительностью к зеоцину (400 мкг/мл) и устойчивостью к гигромицину (200 мкг/мл). Чтобы визуализировать флуоресцентный секреторный груз в клетках, экспрессирующих GalNAc-T2-GFP, клетки трансфицировали 3 мкг соответствующей плазмиды с использованием FuGENE HD (Promega; E2311) за 24–48 ч до визуализации.

Для визуализации живых клеток трансфицированных клеток Flp-In 293 T-REx культуры выращивали на чашках с покровным стеклом, покрытых полиэтиленимином (PEI) (Vancha et al. , 2004 ). Чашку инкубировали с 250 мкл ~25 мкг/мл PEI (Sigma; 181978) в 150 мМ NaCl в течение 10 минут, затем чашку промывали и давали полностью высохнуть перед добавлением клеток. Перед визуализацией клетки обрабатывали 100 мкг/мл циклогексимида из запаса 100 мг/мл в диметилсульфоксиде в течение 15–30 мин, а среду буферировали 15 мМ Na + -HEPES, pH 7.4. Визуализация проводилась при 37°C на конфокальном микроскопе Leica SP5, оборудованном инкубационным столиком и масляным объективом 1,4 NA/63, с использованием размера пикселя 100 нм, интервала Z-шага 0,5 мкм и оптического диапазона ∼30–40. разделы. Z-стеки в среднем предназначались для создания фильмов.

Для визуализации живых клеток нейронов первичные культуры нейронов коры головного мозга крыс готовили, как описано (Govind et al. , 2012), с использованием нейробазальной среды (Thermo Fisher; 21103049), 2% (об./об.) добавки B27 ( Thermo Fisher; 17504044) и 2 мМ L-глютамина (Thermo Fisher; 25030024).Диссоциированные клетки коры от крысят E18 Sprague Dawley высевали в чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм (MatTek; P35G-1.5-14-C), покрытые поли-D-лизином (Sigma; A-003-E) с плотностью 0,25. × 10 6 клеток/мл. Культуры нейронов трансфицировали через 15 дней in vitro 1 мкг кДНК, кодирующей GFP-меченую версию альфа-маннозидазы II Man2A1 (ManII-GFP), и 1 мкг плазмиды, кодирующей ER-мишень ESCargo(FTV) на чашку с использованием 2 мкл реагента Липофектамин 2000 (Thermo Fisher; 11668019). Нейроны инкубировали в течение 48 часов после трансфекции, а затем визуализировали с помощью конфокального микроскопа Leica SP5, как описано выше.Непосредственно перед визуализацией клеточную среду заменяли 2,5 мл Hibernate E (BrainBits).

ImageJ использовался для количественной оценки сигналов секреторного груза, связанных с аппаратом Гольджи, в фильмах. Первым шагом было измерение фоновой клеточной флуоресценции из контрольного фильма нетрансфицированных клеток. Затем для каждой временной точки сигнал от маркера Гольджи, помеченного GFP, использовался для создания маски, и внутри маски измерялся сигнал груза за вычетом фона. Для клеток Flp-In 293 T-REx эти значения были нормализованы к исходной флуоресценции груза, которую измеряли путем количественного определения общей клеточной флуоресценции за вычетом фона через 1 минуту после добавления SLF.Для нейронов коры крысы эти значения были нормализованы к максимальному сигналу груза, измеренному в аванпостах Гольджи.

Культура клеток дрозофилы , инженерия и микроскопия

Клетки S2-DGRC были получены из Центра геномных ресурсов дрозофилы (клеточная линия № 6). Клетки выращивали в среде для клеток насекомых без белка Insect-XPRESS (Lonza; 12-730Q) с добавлением антибиотика-антимикотика (Thermo Fisher; 15240062) в инкубаторе при 25°C. Используемые конструкции ДНК: Ubi-GAL4 (подарок Ричарда Фехона, Чикагский университет), pUASt-ManII-eGFP (подарок Бинга Йе, Мичиганский университет) и либо pUASt-ssBiP-ESCargo*, либо pUASt-ssBiP- ЭСКарго.Трансфекцию проводили с использованием метода диметилдиоактадециламмония (DDAB) (Han, 1996). ДДАБ и среду для культивирования клеток смешивали в соотношении 1:2 и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Для трансфекции лунки шестилуночного планшета 1 мкг ДНК смешивали со 144 мкл раствора ДДАБ/среда, инкубировали 15 мин при комнатной температуре и добавляли эту смесь к 2,6 × 10 6 клеток в 2 мл среды. Трансфицированным клеткам давали расти в течение 3–4 дней перед визуализацией.

Для иммунофлуоресцентной микроскопии покровные стекла инкубировали в 100 мкг/мл ConA в течение 1 ч, трижды промывали в деионизированной воде и сушили перед использованием.Трансфицированные клетки отделяли пипетированием и 250 мкл клеточной суспензии добавляли в свежий шестилуночный планшет, содержащий покровное стекло, покрытое КонА, и 1,75 мл среды. Клеткам давали возможность распространиться в течение 1 ч, а затем фиксировали в 4% формальдегиде, разведенном в фосфатно-солевом буфере (PBS), в течение 10 мин при комнатной температуре. Фиксированные клетки промывали и пермеабилизировали PBS, содержащим 0,1% Triton X-100 (PBST), три раза по 5 мин. Антитело к GM130 (Abcam; ab30637) и антитело к Tango1 (Lerner et al., 2013) разбавляли 1:500 в PBST. Каплю смеси антител объемом 100 мкл помещали на кусок парапленки во влажной камере, на нее переворачивали покровное стекло, покрытое клетками, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Покровное стекло промывали три раза по 5 мин в PBST. Вторичные антитела (Thermo Fisher; А-27039 и А-2145), разбавленные 1:500 в PBST, добавляли на 1 ч при комнатной температуре и образцы промывали три раза по 5 мин в PBST. Наконец, покровное стекло было помещено в ProLong Gold (Thermo Fisher; {«type»:»entrez-protein»,»attrs»:{«text»:»P36930″,»term_id»:»1248281091″,»term_text»:» P36930″}}P36930) и покрыть лаком для ногтей.Визуализация выполнялась на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Zeiss LSM 800 с программным обеспечением Zen blue и масляным объективом Plan Apo 1,4 NA 63×.

Для живой визуализации клеток S2 трансфицированные клетки отделяли пипетированием и добавляли 250 мкл клеток и 750 мкл свежей среды в чашку со стеклянным дном диаметром 35 мм, покрытую ConA, используя процедуру, описанную выше для покровных стекол. Клеткам давали прикрепиться в течение 30 минут, а затем визуализировали при комнатной температуре на лазерном сканирующем микроскопе Zeiss LSM 880 с программным обеспечением Zen black и 63× Plan Apo 1.4 Нефтяная цель. Каждые 30 с в течение 1 ч Z-стек размером ∼2–5 мкм, в зависимости от высоты клетки, регистрировали с шагом 0,37 мкм. После первых 2 минут визуализации добавляли 1 мл среды, содержащей 100 мкМ SLF, в результате чего конечная концентрация SLF составляла 50 мкМ. Z-стеки были проецированы в среднем и количественно определены, как описано выше для культивируемых клеток млекопитающих.

Трансгенные мухи, содержащие плазмиду pUASt-ssBiP-ESCargo, были получены с использованием рекомбинации, опосредованной PhiC31. Вставки были созданы на хромосомах 2L (attP40) и 3R (VK20) с помощью GenetiVision.Обе линии хорошо экспрессировались, и во всех экспериментах в этой статье использовалась вставка VK20. Для экспрессии UASt-ssBiP-ESCargo, а также UASp-YFP-Rab10 из Фондового центра Bloomington Drosophila Stock Center использовалась клетка-драйвер клеток фолликула яйцеклетки-Gal4 из Центра генетических ресурсов Drosophila в Киото (DGRC № 104055). (БДСК № 9789).

Для изучения движения ESCargo в яйцевых камерах трансгенных мух выращивали на агаре с кукурузной патокой при 25°C с использованием стандартных методов.Одно-двухдневных самок выдерживали на дрожжах вместе с самцами в течение 2 сут при 25°С. Рассечение яичников выполняли, как описано (Cetera et al. , 2016). Яичники удаляли у дрожжевых самок в среде для вскрытия/визуализации живых клеток (среда Schneider Drosophila , содержащая 15% фетальной бычьей сыворотки и 200 мкг/мл инсулина). Нити яичников механически удаляли из мышцы с помощью щипцов. Яйцевые камеры старше стадии 9 вырезали из нити овариолы с помощью иглы 27-го калибра.Чтобы вызвать волну трафика ESCargo, яйцевые камеры переносили в пробирку объемом 1,5 мл и инкубировали в свежей среде для визуализации в течение 5 минут при комнатной температуре с 50 мкМ SLF или без SLF в качестве отрицательного контроля. Яичные камеры фиксировали в 4% формальдегиде в PBST в течение 15 мин при комнатной температуре, промывали три раза по 10 мин в PBST и помещали в ∼35 мкл ProLong Gold на предметное стекло с покровным стеклом 22 × 50 мм. Затем покровное стекло запечатывали лаком для ногтей. Визуализация выполнялась на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Zeiss LSM 800 с программным обеспечением Zen blue и 63× Plan Apo 1.4 Нефтяная цель.

Культура клеток Tetrahymena , инженерия и микроскопия

Клетки Tetrahymena thermophila выращивали в течение ночи в SPP (2% протеозопептона, 0,1% дрожжевого экстракта, 0,2% декстрозы, 0,003% железа-ЭДТА) с добавлением 250 мкг/мл пенициллина. G, 250 мкг/мл стрептомицина сульфата и 0,25 мкг/мл фунгизона амфотерицина В, до средней плотности (0,6–2,0 × 10 5 клеток/мл). Для биолистической трансформации растущие клетки впоследствии голодали в 10 мМ трис-буфере, рН 7.4, на 18–20 ч. Подкормленные и голодающие клетки хранили при 30°С при встряхивании со скоростью 99 об/мин, если не указано иное. Плотность культуры измеряли с использованием счетчика Z1 Coulter (Beckman Coulter).

После биолистической трансформации трансформанты отбирали, как описано ранее (Kaur et al. , 2017; Sparvoli et al. , 2018). Трансформанты серийно переносили шесть раз в неделю при возрастающих концентрациях бластицидина и уменьшающихся концентрациях CdCl 2 (до 90 мкг/мл бластицидина и 0.1 мкг/мл CdCl 2 ) в течение как минимум 3 недель перед дальнейшим тестированием.

Для флуоресцентной микроскопии клетки выращивали в течение ночи в 20 мл SPP при 30°C при перемешивании со скоростью 99 об/мин до ~2,0 × 10 5 клеток/мл. Экспрессию трансгена индуцировали 0,5 мкг/мл CdCl 2 в течение 90 мин. Затем клетки однократно промывали 20 мл SPP и ресуспендировали в 20 мл среды без CdCl 2 перед обработкой SLF. Инкубацию с 12,5 мкМ SLF проводили в течение 5, 10 или 30 мин в 24-луночном планшете (2 мл на лунку) при 30°C без перемешивания.Затем клетки фиксировали добавлением охлажденного льдом 4% параформальдегида и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Контроли включали клетки, индуцированные CdCl 2 , которые фиксировали перед обработкой SLF (нулевое время) или выдерживали в течение 60 мин в SPP без SLF. Неиндуцированные клетки выращивали, фиксировали и визуализировали параллельно. Фиксированные клетки трижды промывали PBS, помещали в 30% глицерин в PBS, содержащем 0,1 мМ Trolox (Sigma; 238813) для ингибирования обесцвечивания, и визуализировали при комнатной температуре на конфокальном инвертированном микроскопе с вращающимся диском типа Marianas Yokogawa с использованием конфокального микроскопа 100 × 1. .Масляный объектив 45 NA с программным обеспечением SlideBook 6 (Intelligent Imaging Innovations). Изображения Z-стека были очищены от шума и скорректированы по яркости и контрасту с помощью программного обеспечения Fiji (Schindelin et al. , 2012), и для отображения были выбраны отдельные оптические секции.

Для выявления секретируемых белков методом иммуноблоттинга клетки выращивали в течение ночи в 20 мл SPP до 0,6–0,8 × 10 5 клеток/мл. Клетки (1,0 × 10 5 ) переносили в 2 мл SPP для каждого экспериментального условия: неиндуцированные, CdCl 2 -индуцированные, CdCl 2 -индуцированные и обработанные SLF.Экспрессию белка индуцировали 0,5 мкг/мл CdCl 2 в течение 90 мин при 30°С. Клетки, индуцированные CdCl 2 , однократно промывали SPP и ресуспендировали в 1 мл SPP без или с 12,5 мкМ SLF в течение 5 мин при комнатной температуре. Неиндуцированные клетки промывали и ресуспендировали в SPP в течение 5 мин без SLF. Клетки осаждали центрифугированием и ~500 мкл бесклеточного супернатанта осаждали добавлением одной десятой объема 2% дезоксихолата и 100% ТХУ. Параллельно соответствующие фракции осадка осаждали 10% ТХУ.Нерастворимые в ТХУ осадки суспендировали в буфере для образцов LDS (додецилсульфат лития) при 100°C, содержащем 40 мМ дитиотреитола, и анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблотинга, как описано ранее (Sparvoli et al. , 2018). Кроличье моноклональное антитело против FBKP (Abcam; ab2918) разводили 1:1000 в блокирующем растворе. Белки визуализировали с помощью вторичного антитела к пероксидазе иммуноглобулина G кролика 1:20000 (Sigma; A0545, серия 022M4811) и субстрата максимальной чувствительности SuperSignal West Femto (Thermo Fisher; 34095).

Плазмиды

Все вновь созданные плазмиды, использованные в этом исследовании, задокументированы в дополнительном ZIP-файле в виде текстового документа, а также аннотированных файлов карт/последовательностей, которые можно открыть с помощью SnapGene Viewer (Insightful Science; www.snapgene.com ). Все соответствующие вставки в плазмиды были подтверждены секвенированием. Недавно созданные плазмиды были отправлены в Addgene.

%PDF-1.4 % 4 0 объект (1. Введение) эндообъект 5 0 объект > эндообъект 8 0 объект (2 Ограничение ширины бозона Хиггса на БАК) эндообъект 9 0 объект > эндообъект 12 0 объект (3 настройки моделирования) эндообъект 13 0 объект > эндообъект 16 0 объект (4 стратегии измерения) эндообъект 17 0 объект > эндообъект 20 0 объект (4.1 Метод выбора и извлечения базовой линии) эндообъект 21 0 объект > эндообъект 24 0 объект (4.1.1 Базовая чувствительность для h) эндообъект 25 0 объект > эндообъект 28 0 объект (4.1.2 Чувствительность по затуханию) эндообъект 29 0 объект > эндообъект 32 0 объект (4.2 Улучшенный выбор и реконструкция) эндообъект 33 0 объект > эндообъект 36 0 объект (4.2.1 Выбор струи Хиггса) эндообъект 37 0 объект > эндообъект 40 0 объект (4.2.2 Реконструкция струи Хиггса) эндообъект 41 0 объект > эндообъект 44 0 объект (4.2.3 Маркировка струи Хиггса) эндообъект 45 0 объект > эндообъект 48 0 объект (4.2.4 Корреляция массы струи) эндообъект 49 0 объект > эндообъект 52 0 объект (4.3 Улучшенная чувствительность для h) эндообъект 53 0 объект > эндообъект 56 0 объект (5 достижимых погрешностей на HL-LHC) эндообъект 57 0 объект > эндообъект 60 0 объект (5.1 Понимание распределения массы) эндообъект 61 0 объект > эндообъект 64 0 объект (5.2 Сравнение результатов различных подходов) эндообъект 65 0 объект > эндообъект 68 0 объект (5.3 Результаты по режимам затухания) эндообъект 69 0 объект > эндообъект 72 0 объект (6 Расчет ширины и смещение модели) эндообъект 73 0 объект > эндообъект 76 0 объект (6.1 Работа с подписями MET) эндообъект 77 0 объект > эндообъект 80 0 объект (6.2 Глюоны и трудно найти подписи) эндообъект 81 0 объект > эндообъект 84 0 объект (6.3 Единообразие чувствительности подписей) эндообъект 85 0 объект > эндообъект 88 0 объект (6.4 Расчет ширины) эндообъект 89 0 объект > эндообъект 92 0 объект (6.5 Дополнительные предположения) эндообъект 93 0 объект > эндообъект 96 0 объект (7 Резюме и выводы) эндообъект 97 0 объект > эндообъект 100 0 объект (Процедура Fit и извлечение сигнала \(35fb-1) эндообъект 101 0 объект > эндообъект 104 0 объект (А.1 Обоснование порядка экстраполяции) эндообъект 105 0 объект > эндообъект 108 0 объект (B Идентификация усиленных бозонов Хиггса) эндообъект 109 0 объект > эндообъект 112 0 объект (В.1 регрессия MET) эндообъект 113 0 объект > эндообъект 116 0 объект (B.2 Модель GRU для маркировки Хиггса) эндообъект 117 0 объект > эндообъект 120 0 объект (B.3 Дополнительные графики эффективности мечения) эндообъект 121 0 объект > эндообъект 124 0 объект (B.4 Состязательная нейронная сеть Jet Mass) эндообъект 125 0 объект > эндообъект 128 0 объект (Чувствительность режима затухания C) эндообъект 129 0 объект > эндообъект 133 0 объект > поток xڝVKs6W訝zIf4Lm\eWHɎF’

%PDF-1.4 % 1 0 объект > эндообъект 7 0 объект /Заголовок /Тема /Автор /Режиссер /Ключевые слова /CreationDate (D:20220203021454-00’00’) /ModDate (D:20210607150645+02’00’) /PTEX.Fullbanner (Это pdfTeX, версия 3.14159265-2.6-1.40.20 \(TeX Live 2019/Debian\) kpathsea версия 6.3.1) /В ловушке /Ложь >> эндообъект 2 0 объект > эндообъект 3 0 объект > эндообъект 4 0 объект > эндообъект 5 0 объект > эндообъект 6 0 объект > эндообъект 8 0 объект > эндообъект 9 0 объект > эндообъект 10 0 объект > эндообъект 11 0 объект > эндообъект 12 0 объект > эндообъект 13 0 объект > эндообъект 14 0 объект > эндообъект 15 0 объект > эндообъект 16 0 объект > эндообъект 17 0 объект > эндообъект 18 0 объект > эндообъект 19 0 объект > эндообъект 20 0 объект > эндообъект 21 0 объект > эндообъект 22 0 объект > эндообъект 23 0 объект > эндообъект 24 0 объект > эндообъект 25 0 объект > эндообъект 26 0 объект > эндообъект 27 0 объект > эндообъект 28 0 объект > эндообъект 29 0 объект > эндообъект 30 0 объект > эндообъект 31 0 объект > эндообъект 32 0 объект > эндообъект 33 0 объект > эндообъект 34 0 объект > эндообъект 35 0 объект > эндообъект 36 0 объект > эндообъект 37 0 объект > эндообъект 38 0 объект > эндообъект 39 0 объект > эндообъект 40 0 объект > эндообъект 41 0 объект > эндообъект 42 0 объект > эндообъект 43 0 объект > эндообъект 44 0 объект > эндообъект 45 0 объект > эндообъект 46 0 объект > эндообъект 47 0 объект > эндообъект 48 0 объект > эндообъект 49 0 объект > эндообъект 50 0 объект > эндообъект 51 0 объект > эндообъект 52 0 объект > эндообъект 53 0 объект > эндообъект 54 0 объект > эндообъект 55 0 объект > эндообъект 56 0 объект > эндообъект 57 0 объект > эндообъект 58 0 объект > эндообъект 59 0 объект > эндообъект 60 0 объект > эндообъект 61 0 объект > эндообъект 62 0 объект > эндообъект 63 0 объект > эндообъект 64 0 объект > эндообъект 65 0 объект > эндообъект 66 0 объект > эндообъект 67 0 объект > эндообъект 68 0 объект > эндообъект 69 0 объект > эндообъект 70 0 объект > эндообъект 71 0 объект > эндообъект 72 0 объект > эндообъект 73 0 объект > эндообъект 74 0 объект > эндообъект 75 0 объект > эндообъект 76 0 объект > эндообъект 77 0 объект > эндообъект 78 0 объект > эндообъект 79 0 объект > эндообъект 80 0 объект > эндообъект 81 0 объект > эндообъект 82 0 объект > эндообъект 83 0 объект > эндообъект 84 0 объект > эндообъект 85 0 объект > эндообъект 86 0 объект > эндообъект 87 0 объект > эндообъект 88 0 объект > эндообъект 89 0 объект > эндообъект 90 0 объект > эндообъект 91 0 объект > эндообъект 92 0 объект > эндообъект 93 0 объект > эндообъект 94 0 объект > эндообъект 95 0 объект > эндообъект 96 0 объект > эндообъект 97 0 объект > эндообъект 98 0 объект > эндообъект 99 0 объект > эндообъект 100 0 объект > эндообъект 101 0 объект > эндообъект 102 0 объект > эндообъект 103 0 объект > эндообъект 104 0 объект > эндообъект 105 0 объект > эндообъект 106 0 объект > эндообъект 107 0 объект > эндообъект 108 0 объект > эндообъект 109 0 объект > эндообъект 110 0 объект > эндообъект 111 0 объект > эндообъект 112 0 объект > эндообъект 113 0 объект > эндообъект 114 0 объект > эндообъект 115 0 объект > эндообъект 116 0 объект > эндообъект 117 0 объект > эндообъект 118 0 объект > эндообъект 119 0 объект > эндообъект 120 0 объект > эндообъект 121 0 объект > эндообъект 122 0 объект > эндообъект 123 0 объект > эндообъект 124 0 объект > эндообъект 125 0 объект > эндообъект 126 0 объект > эндообъект 127 0 объект > эндообъект 128 0 объект > эндообъект 129 0 объект > эндообъект 130 0 объект > эндообъект 131 0 объект > эндообъект 132 0 объект > эндообъект 133 0 объект > эндообъект 134 0 объект > эндообъект 135 0 объект > эндообъект 136 0 объект > эндообъект 137 0 объект > эндообъект 138 0 объект > эндообъект 139 0 объект > эндообъект 140 0 объект > эндообъект 141 0 объект > эндообъект 142 0 объект > эндообъект 143 0 объект > эндообъект 144 0 объект > эндообъект 145 0 объект > эндообъект 146 0 объект > эндообъект 147 0 объект > эндообъект 148 0 объект > эндообъект 149 0 объект > эндообъект 150 0 объект > эндообъект 151 0 объект > эндообъект 152 0 объект > эндообъект 153 0 объект > эндообъект 154 0 объект > эндообъект 155 0 объект > эндообъект 156 0 объект > эндообъект 157 0 объект > эндообъект 158 0 объект > эндообъект 159 0 объект > эндообъект 160 0 объект > эндообъект 161 0 объект > эндообъект 162 0 объект > эндообъект 163 0 объект > эндообъект 164 0 объект > эндообъект 165 0 объект > эндообъект 166 0 объект > эндообъект 167 0 объект > эндообъект 168 0 объект > эндообъект 169 0 объект > эндообъект 170 0 объект > эндообъект 171 0 объект > эндообъект 172 0 объект > /ProcSet [/PDF /Text /ImageC /ImageB /ImageI] >> эндообъект 173 0 объект > поток xڝXn6++Qo]g:4(IIv4 YDQ3Lv2oSee=㋟}~4}NG5΄LC/Ƹ?1>xs[X’cI؎Wy$}XxuOb9

|(ERzؗXo0″ (`@>т>д./;ui8rિ1(?+8$mC\Dd6

%PDF-1.4 % 1 0 объект > эндообъект 4 0 объект >> эндообъект 2 0 объект > эндообъект 3 0 объект > поток приложение/pdf

  • 106
  • 2008-10-07T13:48:41+01:002012-06-11T10:35:05-06:002012-06-11T10:35:05-06:00iTextSharp 4.0.7 (на основе iText 2.0.7)uuid: 4d3699ca-acca-4537-aab8-80134ff6f61fuuid:9e2c471a-21d1-4582-b2c0-938f3627908a конечный поток эндообъект 5 0 объект > эндообъект 6 0 объект > эндообъект 7 0 объект > эндообъект 8 0 объект > эндообъект 9 0 объект > эндообъект 10 0 объект > эндообъект 11 0 объект > эндообъект 12 0 объект > эндообъект 13 0 объект > эндообъект 14 0 объект > эндообъект 15 0 объект > эндообъект 16 0 объект > эндообъект 17 0 объект > эндообъект 18 0 объект > эндообъект 19 0 объект > эндообъект 20 0 объект > эндообъект 21 0 объект > эндообъект 22 0 объект > эндообъект 23 0 объект > эндообъект 24 0 объект > эндообъект 25 0 объект > эндообъект 26 0 объект > эндообъект 27 0 объект > эндообъект 28 0 объект > эндообъект 29 0 объект > эндообъект 30 0 объект > эндообъект 31 0 объект > эндообъект 32 0 объект > эндообъект 33 0 объект > эндообъект 34 0 объект > эндообъект 35 0 объект > эндообъект 36 0 объект > эндообъект 37 0 объект > эндообъект 38 0 объект > эндообъект 39 0 объект > эндообъект 40 0 объект > эндообъект 41 0 объект > эндообъект 42 0 объект > эндообъект 43 0 объект > эндообъект 44 0 объект > эндообъект 45 0 объект > эндообъект 46 0 объект > эндообъект 47 0 объект > эндообъект 48 0 объект > эндообъект 49 0 объект > эндообъект 50 0 объект > поток xU]kA’Ej

    .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.