420 вектор: Комбайн вектор 420 (vector 420) 2013 г.в купить в Павловске | Транспорт

Ваше сообщение отправлено.

Ой, что-то пошло не так…

Жатка кукурузная КМС 6-19 для Вектор 410/420 в ЮФО и СКФО. Доставка по РФ.

Жатка кукурузная КМС 6-19 для Вектор 410/420 с НОВЫМИ итальянскими редукторами

 1. мыс;

2. вальцы;

3. отрывные пластины;

4. подавающие цепи;

5. шнек;

6. вертикальный вал;

7. ступица;

8. режущий нож;

Наименование	Жатка КМС-6
Число убираемых рядков	6
Ширина междурядий, см	70
Ширина захвата, м	4,2
Производительность (зерна, кукурузы), га /ч	3
Масса, кг	2250
Габаритные размеры в рабочем положении (длина/ширина/высота), мм	3000/4370/1350

                                   

Жатка кукурузная КМС в агрегате с комбайном производит уборку кукурузы со сбором и последующим обмолотом початков, измельчением и разбрасыванием  листостебельной массы по полю. Модификации жатки позволяют агрегатировать ее практически со всеми известными зерноуборочными комбайнами.

Развитая мысовая часть жатки безупречно подбирает также полеглую кукурузу, что позволяет снизить потери и обеспечить высокое качество уборки. Простота конструкции кукурузной жатки КМС 6, наличие откидных капотов, легко открывающихся ограждений делают машину надежной в работе и удобной в обслуживании.

По сравнению с приспособлениями для уборки кукурузы со сбором листостебельной массы (КМД-6, ПЗКС-6), жатка КМС имеет значительно меньшую конструктивную массу и энергоемкость выполнения технологического процесса, что позволяет на 15…20% увеличить производительность уборки и снизить расход горючего. Навешивается на наклонные камеры комбайнов и не требует доработки их приводов жатки.

Расположенные по всей ширине захвата машины ножи измельчителя позволяют убирать засоренные посевы кукурузы.

Машина обеспечивает достаточно низкий срез и качество измельчения стеблей кукурузы, что не требует дополнительных затрат при вспахивании поля после уборки.

Вы всегда сможете выбрать необходимую Вам модель и купить жатку КМС в нашей компании «КавказАгроСтройТехника». Мы гарантируем быструю доставку, сервис и надежную работу кукурузной жатки КМС.

Агрегатируется с комбайнами «ДОН-1500», КЗС-9-1 «Славутич», КЗС-1218 «Палессе», «TORUM» «Нью Холанд»,  «Вектор», «ACROS«, «CLAAS«, КС «НИВА»   «John Deere«, «Case«, «Massey Ferguson«и др.!!!

VECTOR 425 | 410 » Сельхозтехника

 

Зерноуборочный комбайн VECTOR 425 | 410

ОБЩЕЕ ОПИСАНИЕ

 

VECTOR – оптимальное решение для небольших полей. При средней сезонной наработке в 750 га, невысокой стоимости владения, экономичности этот комбайн является наиболее эффективным средством решения задач фермерских хозяйств.

 

 

ХОРОШЕЕ НАЧАЛО   Удлиненная наклонная камера имеет несколько преимуществ: лучший обзор режущего аппарата, упрощение работы для уборки пропашных благодаря отсутствию приемного битера, возможность работы с широкозахватными адаптерами (например, транспортерная жатка Draper Stream 900) в специальном исполнении комбайна.    Максимально полное использование ширины адаптеров на неровных полях обеспечивается системой пружинного продольно-поперечного копирования рельефа.

 

Единый гидроразъём, которым оснащён комбайн, позволил упростить присоединение адаптеров и сократить время процедуры.

 

 

ПРОДУКТИВНЫЙ ОБМОЛОТ   На комбайне VECTOR установлена классическая однобарабанная МСУ с легко узнаваемой практически идеальной геометрией обмолота, которая заслуженно ценится специалистами за высокую производительность, бережное обращение с зерном и соломой в совокупности с отличными параметрами энергопотребления.   Супербарабан Высокоинерционный барабан самого большого в мире диметра в 800 мм — родовой признак ЗУК Ростсельмаш. Помимо перечисленных выше преимуществ, он обладает ещё одним — непревзойденной приспособленностью к трудным хлебам.

 

Угол охвата подбарабанья в 130° дал возможность увеличить площадь сепарации до 1,1 кв. м. Совокупность геометрических параметров обеспечивает более длительное пребывание зерна в зоне обмолота, вследствие чего достигается почти полная, 95-процентная, сепарация.   Эти показатели сопровождаются крайне низкой степенью повреждения зерна, и далеко не каждая двухбарабанная МСУ способна повторить такие результаты!

 

 

ЗЕРНО К ЗЕРНУ   Проверенная временем система остаточной сепарации, состоящая из 4-клавишного 7-каскадного соломотряса, и эффективная 2-ступенчатая система очистки с автономным устройством домолота обеспечивают ничтожные потери зерна с соломой и половой, а также его чистоту.   Попадающее в бункер зерно имеет высочайшие показатели по чистоте и количеству сечки. При нормальной влажности, фактически, оно готово к реализации.

 

РАСШИРЕННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ   Трансформирующаяся крыша бункера позволяет увеличить его на 30 % — до 6 м3. Или, соответственно, уменьшить при необходимости вертикальные габариты комбайна. Раскрытие производится с помощью электромеханизма, а команда отдаётся с рабочего места.   VECTOR не только эффективно и качественно обмолачивает влажные хлеба, но блестяще справляется с их выгрузкой.   Благодаря гидропульсаторам машина способна без зависания массы и забивания шнеков осуществлять выгрузку зерна влажностью свыше 30%.

 

Гибкая работа с соломой     Важным преимуществом комбайна VECTOR является то, что в своем классе только он может предложить такое разнообразие схем работы с незерновой частью урожая. Солому можно не только измельчать, разбрасывать или укладывать в валок.   Для VECTOR 410 опционально доступен копнитель ёмкостью 12 куб.м, который позволяет собирать солому в копны, автоматически выгружая их на ходу.

 

 

 

ПО СИЛАМ И СРЕДСТВАМ   Возможностей современных экономичных 6-цилиндровых дизельных двигателей с турбонаддувом достаточно для обеспечения всех технологических процессов при любых условиях — при пиковых нагрузках они способны обеспечить дополнительный прирост мощности до 20 %.   Минимум расхода и 16 часов без дозаправки   Известно, что стоимость топлива — одна из самых значительных статей затрат на содержание комбайна. Но только не в случае с VECTOR, который имеет очень низкий показатель эксплуатационного расхода топлива — 1,8…2,5 кг на тонну намолоченного зерна.   Благодаря малому потреблению горючего двигателем и топливному баку объёмом 540 длительность работы без дозаправки может достигать 16 часов.

 

В базовую комплектацию модификаций комбайнов VECTOR теперь входит воздушный компрессор с ресивером на 110 л. С его помощью можно проводить ежесменное обслуживание комбайна в поле. Система обеспечивает продолжительность работы в течение 5 минут при заглушенном двигателе.

 

 

Уверенное движение вперёд 

 

VECTOR оснащен гидростатической трансмиссией, которая обеспечивает бесступенчатую регулировку скорости движения в пределах любой из 3 передач. Широта диапазона рабочих скоростей позволяет оптимизировать загрузку МСУ при работе на полях с разной урожайностью. Версии комбайна с полным приводом и полугусеничным ходом гарантируют уверенную и надёжную работу в любых условиях.

 

 

 

ЭРГОНОМИКА УПРАВЛЕНИЯ И ОБСЛУЖИВАНИЯ

 

Рабочее место оператора на VECTOR оснащено всем необходимым для комфортной работы: шумо- и виброизоляция, система кондиционирования и отопления, панорамное остекление для прекрасного обзора, информационная система Adviser II с черно-белым монитором и голосовым оповещением, удобная панель управления, охлаждающая камера и аудиоподготовка.

 

 

На комбайне VECTOR 425 устанавливается двухместная кабина Comfort Cab II с улучшенной шумо- и пылеизоляцией. Рабочее место с высоким уровнем эргономики включает интегрированную в подлокотник панель управления и новую 16-функциональную рукоятку ГСТ.

 

 

 

 

АДАПТЕРЫ

 

Разные пути к совершенствованию уборки

 

Для небольших хозяйств особенно важен выбор адаптеров и приспособлений, ведь если сделать его грамотно, можно не только позволить комбайну высвободить весь свой потенциал, но и сэкономить немало средств.

 

 

Кукуруза

 

6- или 8-рядковый початкоотделитель и комплект переоборудования молотилки и обеспечат эффективную уборку кукурузы на зерно и стабильность технологического процесса. Початкоотделитель обеспечивает сбор зерен, измельчение и разбрасывание листостебельной массы по полю.

 

 

 

Подсолнечник

8-рядковая специализированная жатка обеспечивает полноту сбора урожая на уровне не менее 98%. Этот показатель недостижим при использовании приспособлений других типов. Адаптер предназначен для работы на любом агрофоне, одинаково эффективно убирает низкорослые и высокорослые сорта.

 

Если в хозяйстве большая часть площадей отведена под кукурузу, а подсолнечником засеваются лишь небольшие поля, рекомендуем приобрести комплект для переоборудования кукурузной жатки на уборку подсолнечника. Приспособления эффективно выполняют свою функцию, а экономическая выгода при вышеобозначенных условиях очевидна.

 

Рапс

Рапсовая приставка для жаток шириной захвата 5/6/7/9 м позволяет повысить полноту сбора урожая и, в зависимости от урожайности, дополнительно получить до 30-100 кг зерна с 1 га посевов. Для достижения максимальной эффективности уборки легкотравмируемых культур предлагается дополнительное оборудование.

 

 

Подборщик

Платформа-подборщик шириной 3,4 или 4,3 м за счёт способности копирования рельефа поля позволяет качественно выполнять подбор предварительно уложенных в валок культур. Надёжная защита элементов адаптера от забивания, наматывания стеблей или сдувания растительной массы ветром обеспечивает его устойчивую работу даже в неблагоприятных условиях.

 

Изреженные низкорослые хлеба

 

 

 

Для уборки изреженных, низкорослых хлебов незаменима зерновая транспортерная (полотняная) жатка Draper Stream 900 шириной захвата 9 м.

При её использовании достигается повышение скорости уборки 10-15 %, что позволяет оптимизировать загрузку молотилки. Специальные колеса, выполняющие функции копирования рельефа поля и поддержки жатки, также могут переставляться в транспортное положение, что устраняет необходимость в использовании транспортной тележки.

 

Соя

Жатки Float Stream шириной захвата 7 и 9 м с гибким режущим аппаратом, который способен эффективно копировать микрорельеф грунта, позволяют значительно сократить потери при уборке сои и других стелящихся культур. Кроме того, данные жатки могут использоваться для уборки традиционных зерновых колосовых культур, для чего предусмотрена возможность фиксации ножа.

 

 

4/20 гуляк пытаются отпраздновать благополучно, какой-то вектор в парк Долорес

Сан-Франциско 420 векторов празднования в парк Долорес

После того, как Хиппи-Хилл в парке Золотых ворот забаррикадировался, чтобы не допустить празднования 420, некоторые энтузиасты марихуаны обратились в парк Долорес, чтобы отметить праздник далеко.

САН-ФРАНЦИСКО — Сегодня 20 апреля — день празднования для сообщества каннабиса. Но празднование выглядело совсем иначе, чем в прошлые годы.

Исторически сложилось так, что 20 апреля — это день, когда энтузиасты марихуаны участвуют в полуденных собраниях и праздниках в 4:20, но в этом году все по-другому.

Огромные толпы собирались на Хиппи Хилл в парке Золотые Ворота и зажигали в унисон. В этом году дымку заменили забором из сетки. Город закрыл эту часть парка до среды.

Мэр Сан-Франциско Лондон Брид напомнил людям, что в условиях пандемии собираться большой толпой просто слишком опасно.

«Мы не хотим суперразбрасывателя. Потому что люди делают еще кое-что, это пасут».

— Мэр Сан-Франциско, Лондон, порода

«Мы не хотим соревнований по суперраспространению.Потому что еще люди делают это, — сказал мэр Брид. — Мы действительно не хотим, чтобы такое мероприятие собиралось вместе с таким большим количеством людей ».

В Apothecarium на Маркет-стрит, менеджер сказал, что то, что было медленным годом, набирает обороты. «Совершенно верно, — сказал Кали Манзелло. — Я имею в виду, что сегодня утром очередь победила меня. Они уже ждали, чтобы я отпер двери. Это захватывающе, кажется, что 4/20 вернулись ».

Она говорит, что рынок меняется, и те, кто любит каннабис, могут делать это даже при социальном дистанцировании.

«Мой новый любимый продукт, который становится очень популярным в последние несколько месяцев, — это маленькие собачьи выгулы. Индивидуальные, самообслуживания, одного размера. Итак, вы получаете этот маленький крошечный кусочек, и он только для вас, и вы можете получить упакуйте и поделитесь ими со своими друзьями, чтобы не пересечь эти границы ».

Те, кто хочет отпраздновать, сказали, что они делают это так же, как они пережили COVID-19, в социально отдаленных стадах. «Безопасно», — сказала Кири из Сан-Франциско. «Ну, я полагаю, социальное дистанцирование в парке.Мы просто собираемся потусоваться, немного позагорать и покурить травку ».

В дополнение к тем заборам, о которых мы вам рассказывали, мы также слышали, что город разместил рейнджеров в парках по всему городу, чтобы препятствовать любым крупным социальным мероприятиям.

Картинки и коллекционные предметы дизайн футболки High Standards мгновенная загрузка цифровой клипарт svg, jpeg, png вектор травы 420 svg

дизайн футболки High Standards мгновенная загрузка цифровой клипарт svg, jpeg, png вектор травы 420 svg

дизайн футболки High Standards мгновенная загрузка цифровой клипарт svg, jpeg, png weed vector 420 svg, стандарты мгновенная загрузка цифровой клипарт svg, jpeg, png weed vector 420 svg дизайн футболки High и т. Д.) — 1 x файл PNG, Прозрачный фон — высокое разрешение 300 точек на дюйм — 1 x JPG МГНОВЕННАЯ ЗАГРУЗКА • Никакие физические предметы не будут отправлены, высокие стандарты — 420 Weed Vector — мгновенная загрузка Вы получите 3 следующих файла: — 1 векторный файл SVG (совместим с Silhouette Studio Cameo , Cricut, оптовые цены Быстрая доставка Лучшее качество по самой низкой цене.png weed vector 420 svg дизайн футболки Высокие стандарты мгновенная загрузка цифровой клипарт svg, jpeg, eurovent.eu.

дизайн футболки Высокие стандарты мгновенная загрузка цифровой клипарт svg, jpeg, png вектор травки 420 svg

Walk Or Running In The Beach, Эти диски также имеют открытое покрытие и устойчивое к нагрузкам покрытие для улучшения пылеудаления и сокращения выбросов. Наш широкий выбор элегантен для бесплатной доставки и бесплатного возврата, S Navy Red E-6 Mess Manager Специалист МС: Одежда.Возьмите пару, чтобы оживить свой образ, или подарите их в качестве подарка, который украсит любую коллекцию ювелирных изделий. Прокладки Sterling Seal # 7157 EPDM легко прилегают к неровным поверхностям фланца. * Прочный тканевый корпус с акцентами из натуральной черной кожи. дизайн футболки Высокие стандарты мгновенная загрузка цифровой клипарт svg, jpeg, png вектор травки 420 svg , общий вес 00 карат соответствует диапазону 0,4 грамма * Sparkly Cz * 4/8 л (верхняя часть кольца) * очень хорошо Состояние — отличное ПОЖАЛУЙСТА, ПОСЕТИТЕ НАШ МАГАЗИН. Пожалуйста, не забудьте заблокировать проект, если вы хотите изменить его размер (60 x 54 и 70 x 54 для нашего тканого материала высокой четкости), сумка 11 1/2 дюймов шириной x 16 дюймов длиной с застежкой на шнурок.Другие оправы и опоры для серег продаются отдельно в белом и желтом золоте 10/14 карат в нашем магазине. Сообщите об этом бабушке особенным и захватывающим образом, дизайн футболки Высокие стандарты мгновенная загрузка цифровой клипарт svg, jpeg, png weed vector 420 svg , цена будет выше (мы можем обсудить это через конво), пожалуйста, свяжитесь с перед покупкой и мы с радостью поможем. Характеристики продукта: Диаметр наконечника: 3 дюйма, 7 л. 348 CID V8 — Chevrolet Bel Air 6, одноразовые игольчатые фильтры, не требующие замены мембран и чистки фильтров, размеры: высота 300 мм, ширина 62 мм.Кошачьи стикеры: идеально подходят для дома. дизайн футболки Высокие стандарты мгновенная загрузка цифровой клипарт svg, jpeg, png вектор 420 svg .

дизайн футболки высокие стандарты мгновенная загрузка цифровой клипарт svg, jpeg, png вектор травки 420 svg

Мгновенная загрузка 5 коллажных листов для цифровой печати Сувенирные дорожные этикетки из Европы Этикетки STEAMTRUNK Винтажные этикетки для багажа, 1961 г. Topps cfl football # 66 Charles Baillie montreal alouettes футбольная карточка NM. Комбинированная доставка, Stubby Kaye Элис Фэй Джин Нельсон и актеры декабрь 1974 г. Автограф с автографом. из ХОРОШИХ НОВОСТЕЙ в театре Сент-Джеймс, Нью-Йорк, Бродвей, антикварное блюдо из сельдерея NIPPON, набор соленых погребов Morimura Bros. Подлинный расписанный вручную фарфор Nippon 1911-1921 гг. Листья листвы.БОСТОНСКИЙ ТЕРЬЕР ПЛИТКА Пикабу собака мозаика подарок для любителя животных щенок, Клипарт для лучших друзей КОММЕРЧЕСКАЯ ЛИЦЕНЗИЯ Включено Портрет Создатель душа сестра настраиваемый клипарт лучший подарок подружке невесты Генри. Винтажная керамическая ваза 1970-х годов Капельная глазурь Изумрудно-зеленая середина века Современная красивая форма Керамическая посуда Кассидей MCM, Чаша из желтой березы из капа из дерева Уникальная форма и дизайн. Античный керамический тигель литейный завод редких плавильных котлов с подставками. Винтажная Германия Пепельница Винтажная W-Германия Керамическая Пепельница 553 Винтажная пепельница для сигар, Стеклянный изолятор Vintage Whitall Tatum № 1 с треугольником и колышком цвета морской волны CD 154-8670e.Афроамериканская свобода PNG Dxf черная королева Свобода 1865 года svg Черная история 1865 года черный король флаг США, Пабло Пикассо Рисунок модернистского французского обнаженного Пикассо Испанский балет танцоров-геев. Сидеть всю ночь 1907 BAMFORTH Романтическая пара Винтажная открытка с комиксами ПАРЛАМЕНТСКИЕ ЗАПИСИ, Стеклянная статуэтка бабочки Дутое стекло, статуэтка насекомого, художественная стеклянная скульптура, коллекционная стеклянная композиция бабочки, Вирджиния-Сити, винтажный фиолетовый войлок, сувенирный настенный вымпел, дилижанс, Монтана, витражная мозаика Премиум, дуб и стена в обрамлении грецкого ореха art Красочный колибри среднего размера ручной работы.

Разрешимость векторной задачи алгоритмом свертки линейных критериев

1.

В. А. Емеличев, М. К. Кравцов, О. А. Янушкевич, “Лексикографические оптимумы в многокритериальной задаче дискретной оптимизации”, Матем. Заметки [ Матем. Примечания ] 58 , № 3, 365–371 (1995).

MathSciNet Google Scholar

2.

А. М. Джеффрион, «Собственная эффективность и теория максимизации вектора», J.Математика. Анальный. Прил. , 22 , 618–630 (1968).

Артикул МАТЕМАТИКА MathSciNet Google Scholar

3.

Михалевич В.С., Волкович В.Л., Вычислительные методы анализа и проектирования сложных систем Наука, Москва (1982).

Google Scholar

4.

В. В. Подиновский, В. Д. Ногин, Парето-оптимальные решения многокритериальных задач , Наука, Москва (1982).

Google Scholar

5.

Ю. Дубов А.А., Травкин С.И., Якимец В.Н., Многокритериальные модели формирования и выбора вариантов системы , Наука, Москва (1986).

Google Scholar

6.

Р. Э. Буркард, Х. Кейдинг, Дж. Краруп и П. М. Прузан, «Взаимосвязь между оптимальностью и эффективностью в задачах многокритериального программирования 0–1», Comput.Опер. Res. , 8 , № 4, 241–247 (1981).

Google Scholar

7.

В. А. Емеличев, В. А. Перепелица, “Сложность дискретных многокритериальных задач”, Дискрет. Мат. [ Дискретная математика. Прил. ], 6 , № 1, 3–33 (1994).

MathSciNet Google Scholar

12.

К. Х. Пападимитриу и К. Стейглиц, Комбинаторная оптимизация: алгоритмы и сложность , Прентис-Холл, Энглвуд Клиффс, Нью-Джерси (1982).

Google Scholar

Route 420 Shield SVG | Route 420 Shield Лист марихуаны Svg | Логотип Route 420 Shield | Файл svg с изображением листьев марихуаны Скачать

Описание продукта

Route 420 Shield Svg

Cut для Cricut и Silhouette включены в эту цифровую загрузку. Отлично работает с Adobe Illustrator, Cricut Design Space, Coreldraw, раскройной машиной Cricut, Silhouette Studio и т. Д. Перед покупкой убедитесь, что ваша машина и программное обеспечение совместимы.

ВАЖНО:
— Этот список предназначен для мгновенной загрузки, и никакие физические предметы не будут отправлены.
— Мгновенная цифровая загрузка, содержащая
— SVG
— DXF
— PNG
— PDF
— EPS
— Иногда, в редких случаях, если файлы не работают в Silhouette, вам нужно отследить PNG
— из-за цифрового характера товара возврат не принимается

ВЫ НЕ МОЖЕТЕ ИСПОЛЬЗОВАТЬ ЭТОТ ЦИФРОВОЙ ФАЙЛ ДЛЯ:
— Продавать или делиться полной / частичной цифровой коллекцией.
— Запрещается перепродажа ЛЮБЫХ приобретенных файлов, коммерческая лицензия НЕ дает вам права продавать дизайн или любую его часть для создания других дизайнов для покупки

ВЫ МОЖЕТЕ ИСПОЛЬЗОВАТЬ ЭТОТ ЦИФРОВОЙ ФАЙЛ ДЛЯ:
— Создавайте предметы для личного пользования.
— Создавайте и продавайте товары для коммерческого использования на любых печатных материалах, но вам не разрешается загружать эти цифровые файлы на другие веб-сайты.

• JPG, PNG, SVG, CDR, AI, PDF, EPS, DXF

1. 1.Все файлы представлены только в цифровом виде. Никакие материалы или продукты для печати не будут доставлены или отправлены на ваш физический адрес. Как только вы купите его, он будет немедленно отправлен вам на ваш зарегистрированный адрес электронной почты или будет доступен в вашей учетной записи на нашем сайте.
2. 2. Все типы водяных знаков будут удалены после покупки цифрового файла.
3. 3. Перед покупкой любого продукта убедитесь, что на этих рисунках показано все необходимое программное обеспечение.
4. 4. После подтверждения оплаты доступна мгновенная загрузка файла, это может занять несколько минут.
5. 5. Из-за природы цифровых файлов. Здесь нет возможности возврата или обмена. Все продажи для нас окончательны.
6. 6. Если у вас есть какие-либо вопросы относительно цифровых файлов или вы недовольны нашим дизайном, пожалуйста, свяжитесь с нами или напишите нам по адресу [email protected]. Мы всегда поможем вам найти лучшее решение для любой проблемы.

Listeria monocytogenes как вектор вакцины: ослабление вирулентности или существующий противовоспалительный иммунитет не снижает терапевтической эффективности

Abstract

Бактерия L.monocytogenes представляет собой предполагаемый носитель вакцины, основанный на наблюдении, что этот патоген реплицируется во внутрицитоплазматической среде, облегчая доставку Ag к эндогенному пути процессинга и презентации Ag с последующей стимуляцией пептид-специфичных MHC класса I-ограниченных эффекторных клеток CD8 ⁺ . В этом отчете мы оцениваем ослабленные вирулентностью штаммы Listeria monocytogenes в качестве векторов вакцины и исследуем, ограничивает ли существующий противовоспалительный (антилистический) иммунитет его эффективность в качестве терапевтической противораковой вакцины.После иммунизации мутантами с ослабленной вирулентностью мы обнаружили, что эффективность L. monocytogenes в качестве рекомбинантной противораковой вакцины остается неизменной. Кроме того, мы обнаружили, что лечение антибиотиками, начатое через 24 или 36 часов после терапевтической иммунизации рекомбинантным L. monocytogenes , позволяет полностью развить противоопухолевый ответ. Мы также демонстрируем, что потенциал вакцинного вектора L. monocytogenes не ограничен у животных с существующим антистериальным иммунитетом.Для этих последних исследований мышей, ранее иммунизированных L. monocytogenes дикого типа , инфузировали клетками меланомы, а затем через 5 дней заражали рекомбинантным опухолевым Ag, экспрессирующим L. monocytogenes . В совокупности эти результаты добавляют дополнительную поддержку для использования L. monocytogenes в качестве вектора вакцины и подчеркивают его потенциал для многократного использования для стимуляции повторных ответов, сопутствующих первичным клеточно-опосредованным ответам на вновь доставленные гетерологичные опухолевые эпитопы.

Бактерия Listeria monocytogenes (Lm) ³ была тщательно изучена для понимания механизмов внутриклеточного патогенеза, а также развития приобретенного клеточно-опосредованного иммунитета к патогенам, которые могут находиться и реплицироваться в цитоплазме инфицированных клеток-хозяев (1, 2). Многие из бактериальных детерминант, необходимых для патогенеза, включая внутриклеточный рост и распространение Lm, были идентифицированы и расположены в области хромосомы размером 10 т.п.н., называемой регулятороном PrfA, который включает девять открытых рамок считывания (3).Контроль инфекции Lm, по-видимому, имеет два различных компонента: врожденный или конститутивный иммунитет (неспецифический) и адаптивный или защитный иммунитет (специфичный для Listeria , ). Вслед за начальной волной конститутивного ответа стимулируются субпопуляции Т-клеток, специфичные для Listeria , CD4, ⁺ и CD8, ⁺ . CD4 ⁺ Т-клетки опосредуют реактивность гиперчувствительности замедленного типа (4), а также сообщается о роли Т-лимфоцитов CD4 ⁺ в защитном антилистериальном иммунитете (5, 6).Популяция Т-клеток CD8 ⁺ считается субпопуляцией, ответственной за защиту, как показали исследования адоптивного переноса и исследования истощения субпопуляции Т-клеток in vivo (4, 7, 8, 9).

Lm предлагается в качестве носителя вакцины на основании наблюдения, что этот патоген реплицируется во внутрицитоплазматической среде, облегчая, таким образом, доставку Ag к эндогенному пути процессинга и презентации Ag, и был опубликован ряд исследований, подтверждающих его потенциал вектора вакцины.Например, иммунизация мышей штаммом Lm, который секретирует эпитоп, полученный из нуклеопротеинов (NP) вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), стимулирует NP-специфические эффекторные клетки CD8 ⁺ , которые защищают от летального заражения LCMV (10), и кроликов иммунизируют со штаммом Lm, который секретирует Ag, полученный из вируса папилломы, защищены от инфекции вирусом папилломы (11). В моделях опухолей мышей иммунизация штаммом Lm, который секретирует детерминант NP гриппа (NP гриппа), стимулирует CD8 ⁺ CTL, которые защищают от карцином почек или толстой кишки, сконструированных для экспрессии NP гриппа (12).Регрессия солидных опухолей B16F10, экспрессирующих NP гриппа, была показана после иммунизации штаммом Lm, экспрессирующим NP гриппа (13), и иммунизации конструкциями Lm, которые экспрессируют белок E7 вируса папилломы человека (белок, связанный с раком шейки матки), стимулирует клеточно-опосредованный иммунный ответ, который опосредует регресс трансдуцированной E7 линии опухолевых клеток (14).

В совокупности эти данные убедительно свидетельствуют в пользу продолжения оценки эффективности рекомбинантного Lm в качестве вакцинного штамма.Несколько вопросов, которые еще предстоит решить до общего использования Lm в качестве вектора вакцины, включают вопрос о том, сохраняется ли эффективность при использовании штаммов с ослабленной вирулентностью в качестве вектора доставки из соображений общей безопасности. Кроме того, ослабленный Lm может быть желательным для лечения онкологических пациентов, у которых потенциально ослаблен иммунитет из-за длительной химио / лучевой терапии. Кроме того, учитывая неизвестный статус иммунитета к любому переносчику в общей популяции, важно оценить, снижается ли эффективность у хозяев с существующим противовекторным иммунитетом.Последнее является критическим соображением, поскольку эксперименты с рекомбинантным вирусом осповакцины или аденовируса показывают, что существующий иммунитет к вектору резко снижает первичные ответы и желаемые результаты при их повторном использовании (15, 16, 17, 18). В этом исследовании с использованием модели метастазов меланомы легких мышей мы обнаружили, что ослабление вирулентности не снижает терапевтическую эффективность Lm в качестве вектора вакцины, а также что существующий антилистический (противовоспалительный) иммунитет не препятствует развитию терапевтических ответов против меланомы после последующей иммунизации. с рекомбинантными вакцинными штаммами Lm.

Материалы и методы

Бактерии

Следующие бактериальные штаммы были использованы в качестве иммуногенов для описанных исследований: Lm 10403 серотипа 1 (первоначально полученный от доктора Э. Холла, Вашингтонский государственный университет, Пуллман, Вашингтон), белок 2, связанный с тирозиназой (TRP-2), экспрессирующий штамм Lm (происхождение которого подробно описано в другом месте ⁴ ), штамм Lm дикого типа (Wt), экспрессирующий OVA (производное, описанное ранее (19)), экспрессирующий OVA actA ^— штамм Lm (20) и OVA, экспрессирующий L461T листериолизин O (LLO) штамм Lm (21).Вектор интеграции pPL2 (22), содержащий вставку, кодирующую OVA в рамке считывания, был использован для получения экспрессирующих OVA рекомбинантных штаммов actA ^— и L461T LLO, содержащих единственную копию последовательности OVA, интегрированную в безвредный сайт Listeria геном. Вирулентность поддерживается повторным пассажем у мышей BALB / c или C57BL / 6.

Мыши и иммунизация

Шестинедельные самки мышей C57BL / 6 были приобретены в лаборатории Джексона (Бар-Харбор, штат Мэн), и им предоставили неограниченный доступ к пище и воде.Восьминедельных мышей C57BL / 6 иммунизировали путем инъекции через хвостовую вену ~ 0,1 LD ₅₀ жизнеспособных Lm в 0,2 мл PBS. Для вторичной иммунизации мышам тем же путем вводили ~ 8000 КОЕ в 0,2 мл PBS. Вакцинную конструкцию плазмидной ДНК pUbgp100 получали путем субклонирования кДНК gp100, полученной из линии клеток меланомы, в конструкцию плазмиды pCMVi (-h4) Ubs по методике, описанной ранее (23, 24). Плазмидная конструкция pUbgp100 кодирует слитый белок убиквитион / gp100, и экспрессия этого химерного белка регулируется последовательностями промотора CMV и интрона A CMV.Наборы Plasmid Giga (Qiagen, Chatsworth, CA) использовали для создания крупномасштабных препаратов плазмидной ДНК (3–10 мг / мл). Для иммунизации плазмидной конструкцией pUbgp100 мыши C57BL / 6 в возрасте от 6 до 8 недель получали первую из серии из трех внутримышечных инъекций. иммунизация (через переднюю большеберцовую мышцу) с 3-недельными интервалами 100–125 мкг плазмидной ДНК в 50 мкл физиологического раствора. Все эксперименты на животных проводились с одобрения Институционального комитета по уходу и использованию животных.

Клеточные линии и реагенты

Клеточная линия RMAS-K ^d (предоставлена ​​Dr.М. Беван, Вашингтонский университет, Сиэтл, Вашингтон) поддерживали в RPMI 1640 (Life Technologies, Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк) с добавлением 10% FCS и 200 мкг / мл G-418 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури). . Линия опухолевых клеток меланомы, экспрессирующая SIINFEKL (B16-MO5, предоставленная доктором К. Роком, Медицинский центр Массачусетского университета, Вустер, Массачусетс, США (25)), поддерживалась в среде DMEM плюс 10% FCS и 100 мкг / мл G-418. . Пептид SIINFEKL, производный от OVA, был приобретен у SynPep (Дублин, Калифорния), а пептид TRP-2 aa180–188 мыши (K ^b рестриктирован, однобуквенный код SVYDFFVWL), пептид LCMV NP aa 396–404 (D ^b -ограниченный однобуквенный код FQPQNGQFI) и пептид gp100 aa 25–33 (D ^b -ограниченный однобуквенный код KVPRNQDWL) были синтезированы в Портлендском медицинском центре по делам ветеранов (Портленд, штат Орегон).

Перечень метастазов в легких

Опытным или контрольным мышам вводили 7–10 × 10 ⁵ клеток B16-MO5 (экспрессирующие SIINFEKL) в объеме 0,2 мл DMEM через хвостовую вену. От девятнадцати до 21 дня после инфузии опухоли животных умерщвляли вдыханием CO ₂ и удаляли легкие. Легкие помещали в PBS и подсчитывали количество отдельных видимых очагов опухоли с помощью препаровального микроскопа. В некоторых случаях легкие погружали в отбеливающий раствор, состоящий из 67% этанола, 9% формальдегида и 4% ледяной уксусной кислоты, и через 24–48 часов подсчитывали количество видимых очагов опухоли.

Лечение антибиотиками

Исходный раствор ампициллина (Sigma-Aldrich) готовили с концентрацией 10 мг / мл. После иммунизации животным вводили 2 мг лекарственного средства в объеме 0,2 мл внутрибрюшинно. маршрут каждые 12 часов, всего шесть инъекций в течение 72 часов.

Анализ ELISPOT для подсчета клеток, секретирующих IFN-γ

За шестнадцать до 18 часов перед использованием 96-луночные планшеты с нитроцеллюлозой (Millipore, Bedford, MA) были покрыты 100-500 нг / лунку антител против мышиного IFN-γ захватывающего Ab (BD PharMingen, San Diego, CA), разведенного в PBS и добавляют в объеме 100 мкл. За час до использования планшеты промывали стерильной средой или стерильным PBS, а затем блокировали средой для культивирования клеток (RPMI 1640 или DMEM), содержащей 5–10% FCS. Для подсчета пептид-специфических клеток клетки RMAS-K ^d выдерживали при комнатной температуре в течение 16–18 ч, затем ресуспендировали при 1 × 10 ⁶ клеток / мл и пульсировали 1 × 10 ^–7 М пептиды SIINFEKL, TRP-2 или LCMV NP. Клетки, обработанные импульсным пептидом, инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч, облучали (2500 рад), дважды промывали RPMI 1640, а затем добавляли в планшеты для ELISPOT в количестве 100000 клеток / лунку в объеме 100 мкл.Для подсчета эффекторных клеток, специфичных для меланомы, клетки меланомы B16-MO5 были обработаны трипсином из сливных колб T-25, облучены 6000 рад и добавлены в планшеты ELISPOT в количестве 5–10 000 клеток / лунку в объеме 100 мкл в среде RPMI 1640 с добавлением. с 10% FCS и 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.

Для подсчета частот эффекторных клеток готовили одноклеточные суспензии иммунных клеток селезенки от мышей, предварительно иммунизированных Lm, и добавляли в планшеты для ELISPOT в количестве 25–100 000 клеток / лунку к клеткам RMAS-K ^d с импульсным пептидом.После 24-часовой инкубации при 37 ° C планшеты промывали четыре раза 0,05% Tween 20-PBS и добавляли биотинилированное антитело для определения антител против IFN-γ мыши (BD PharMingen) в количестве 500 нг / лунку в объеме 100 мкл. Затем планшеты инкубировали в течение ночи при 4 ° C, четыре раза промывали 0,05% Tween 20-PBS и затем добавляли 100 мкл стрептавидина AKP в разведении 1/1000 (BD PharMingen). Через 1 час при комнатной температуре планшеты промывают четыре раза 0,05% Tween 20-PBS, а затем в каждую лунку добавляют субстрат для обнаружения BCIP / нитросиний тетразолий (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD).Через 5–20 мин планшеты промывают дистиллированной H ₂ O и дают высохнуть. Пятна подсчитывали с помощью микроскопа Zeiss, оснащенного программным обеспечением KElispot (Zeiss, Оберкохен, Германия).

Пептид-специфические эффекторные клетки

Мышей иммунизировали штаммами Lm, экспрессирующими OVA или TRP-2, или плазмидой, содержащей gp100, и через 10 дней удаляли селезенки и готовили суспензии единичных клеток. Клетки иммунной селезенки совместно культивировали с облученными (2500 рад) нормальными клетками селезенки (без эритроцитов), которые подвергали импульсной обработке в течение 2 часов с концентрацией 10 ^-8 M либо SIINFEKL, TRP-2, LCMV NP, либо пептида gp100.Клетки сокультивировали при соотношении 1: 1 в колбах Т-75 см ² при 1 × 10 ⁸ общих клеток / колбу. Клетки культивировали в RPMI 1640 с добавлением заменимых аминокислот (Life Technologies), 10% инактивированной нагреванием FCS, 100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 5 × 10 ^-5 M 2-ME и 30 Ед. / мл hrIL-2 (Tecin; Программа по модификаторам биологического ответа, Национальный институт рака, Фредерик, Мэриленд). После 6 дней культивирования жизнеспособные клетки собирали и повторно стимулировали в течение дополнительных 6 дней нормальными клетками селезенки с импульсной обработкой пептидом и в идентичных условиях совместного культивирования.Жизнеспособные клетки собирали после второй фазы культивирования и либо использовали в качестве индикаторных клеток в анализах ELISPOT, либо адоптивно переносили в количестве 8 × 10 ⁶ клеток на реципиента через хвостовую вену в объеме 0,2 мл.

Статистический анализ

Среднее значение и медиана между контрольной и лечебной группами оценивали (тест ANOVA t ) с использованием статистического программного обеспечения JMP (Институт SAS, Кэри, Северная Каролина).

Результаты

Рекомбинантные мутанты Lm с ослабленной вирулентностью стимулируют терапевтические противоопухолевые ответы

Использование вектора на основе Lm в качестве противораковой вакцины привлекательно из-за внутренней способности этого внутриклеточного патогена стимулировать сильный Т-клеточный ответ CD4 ⁺ и CD8 ⁺ . Для клинического применения Lm в качестве рекомбинантной вакцины необходимо решить различные проблемы безопасности. Поскольку для Lm известны многие критические факторы вирулентности, можно разработать определенные мутанты с ослабленными фенотипами и оценить их на потенциал вакцинного вектора. Для этих исследований мы использовали рекомбинантные штаммы Lm, экспрессирующие модель Ag OVA (19), и вариант линии клеток меланомы B16, которая также экспрессирует OVA (клетки B16-MO5) в модели меланомы легких мышей (25). Мы решили изначально использовать ответы на представленный h3-K ^b пептид SIINFEKL OVA в качестве антигенной мишени в этой системе, поскольку Т-клеточный ответ CD8 ⁺ на эту детерминанту хорошо охарактеризован, а рекомбинантные штаммы Lm, экспрессирующие OVA, имеют было описано ранее (19).

Мы оценили два штамма Lm с ослабленной вирулентностью на их способность стимулировать CD8 ⁺ Т-клеточные ответы, которые могут ингибировать рост опухоли. Для наших первоначальных исследований мы использовали мутантный штамм с делецией actA , который больше не распространяется из клетки-клетки и имеет LD ₅₀ у мышей C57BL / 6 ∼2 × 10 ⁸ КОЕ (20), и штамм с заменой лейцина на треонин в молекуле LLO в положении 461, в результате чего LD ₅₀ у мышей C57BL / 6 составляет ∼1 × 10 ⁸ КОЕ (21).C57BL / 6 сначала инъецировали 7 × 10 ⁵ OVA-экспрессирующих опухолевых клеток меланомы. Эта доза клеток меланомы такова, что легочная форма заболевания легко проявляется, но титруется до минимально возможной дозы, которая дает воспроизводимое заболевание легких и, таким образом, вероятно, будет аналогична той, которая наблюдается клинически. Через пять дней животных с опухолями иммунизировали внутривенно. с дозой приблизительно 0,1 LD ₅₀ различных аттенуированных вакцинных штаммов Lm. Хотя доза иммунизации для ослабленных штаммов увеличена по сравнению с дозой Wt, относительная вирулентность ослабленных штаммов, выраженная как 0. 1 LD ₅₀ доза идентична по сравнению с дозой Wt. Результаты в таблице I⇓ показывают, что аналогичные уровни терапевтического противоопухолевого иммунитета очевидны после терапевтической иммунизации мутантами, экспрессирующими OVA с ослабленной вирулентностью, по сравнению с экспрессирующим Wt OVA положительным контрольным штаммом Lm у животных с опухолями. Количество метастазов в легких у животных, иммунизированных в терапевтических условиях с помощью actA ^— рекомбинантного Lm (среднее значение 3 ± 3) или рекомбинантного Lm L461T LLO (среднее значение 4 ± 2), аналогично количеству метастазов в легких у животных. терапевтически иммунизировали Wt OVA-экспрессирующим Lm (среднее 8 ± 5).Иммунизация родительским контролем (Lm, не экспрессирующая OVA) не дает противоопухолевого эффекта (все группы с> 250 опухолевыми узелками / легкое), что позволяет предположить, что неспецифическое воспаление и активация клеток не способствуют эрадикации опухоли в этой модели. Эти результаты показывают, что стимуляция терапевтических противоопухолевых ответов Lm с ослабленной вирулентностью неотличима от таковых после иммунизации Wt Lm, экспрессирующей целевой Ag.

Иммунизация ослабленными рекомбинантными штаммами Lm стимулирует терапевтические противоопухолевые ответы

Лечение антибиотиками и стимуляция противоопухолевого ответа

Эти штаммы Lm сохраняют чувствительность к ряду антибиотиков, и их можно легко контролировать (при необходимости) с помощью антибактериальной терапии (такие методы лечения недоступны для рекомбинантных вирусных векторов).Следовательно, схемы иммунизации, включающие антибиотики, могут значительно снизить риск для пациента. Ранее было определено, что лечение антибиотиками через 24–48 часов после иммунизации Wt Lm не снижает стимуляции антистериальных иммунных эффекторных клеток (26). В пилотных исследованиях мы определили, что лечение антибиотиками через 24 или 36 часов после иммунизации штаммом Lm, экспрессирующим Wt OVA, не влияет на стимуляцию SIINFEKL-специфических эффекторных клеток, а также не влияет на противоопухолевую эффективность этого штамма в модели профилактической опухоли. , (данные не показаны).Поскольку противораковые вакцины вводятся в терапевтических целях, мы стремились определить у животных с опухолями, повлияет ли иммунизация вакцинным штаммом Lm с последующим лечением антибиотиками противоопухолевую эффективность. Для проведения этих экспериментов животных, ранее инъецированных клетками меланомы B16, экспрессирующими OVA, иммунизировали Wt OVA-экспрессирующим штаммом L. monocytogenes , а затем обрабатывали ампициллином через 24 или 36 часов после иммунизации. Подсчет метастазов в легких очень четко показывает, что лечение антибиотиками через 24 или 36 часов после иммунизации не изменяет терапевтическую эффективность вакцины по сравнению с мышами с опухолью, получавшими только вакцину (Таблица II).Нет значительных различий в количестве метастазов в легких, наблюдаемых в группах, получавших антибиотики (среднее значение 18 ± 4,5 через 24 часа или 26 ± 19 через 36 часов) по сравнению с таковым в иммунизированной контрольной группе (среднее значение 19 ± 16). ). Как также показано, аналогичные результаты наблюдались для экспрессирующих OVA штаммов Lm с ослабленной вирулентностью после лечения антибиотиками. Эти данные подтверждают, что терапевтическая эффективность Lm как рекомбинантной вакцины не снижается после опосредованного антибиотиками контроля инфекции.

Лечение антибиотиками после терапевтической иммунизации не снижает эффективность Lm как рекомбинантной вакцины

Существующий антистериальный иммунитет не является препятствием для эффективности вакцины

Ранее мы определили, что экспансия эффекторных клеток до эпитопов «памяти», а также примирование наивных Т-клеток CD8 ⁺ к вновь доставленным антигенным детерминантам может происходить одновременно после иммунизации Lm (27).У людей Lm в основном попадает орально. Однако, поскольку оральная инфекция у мышей неэффективна, системное воздействие и последующий иммунитет моделируются следующим образом: i. v. администрация. Следовательно, следуя i.v. первичной инфекции Wt Lm, мы оценили противоопухолевые ответы после второго в / в. инъекция рекомбинантного Lm в модельную систему мышиной меланомы B16. Введение мышам Wt Lm приводит к неконтролируемой репликации бактерий в течение первых 72 часов, после чего количество КОЕ в селезенке начинает снижаться (рис.1⇓, левая панель ). Через шесть дней после инъекции селезеночные КОЕ практически отсутствуют. Это открытие резко контрастирует с клиренсом Lm из селезенки иммунных животных, где наблюдается быстрое снижение количества КОЕ в селезенке. К 72 часам после заражения иммунными мышами КОЕ в селезенке ниже пределов обнаружения. Чтобы определить, происходит ли стимуляция первичного ответа на рекомбинантный гетерологичный Ag OVA у Lm-иммунных мышей, мышей иммунизировали Wt Lm (~ 800 КОЕ), а затем 28 дней спустя иммунизировали Wt-экспрессирующим рекомбинантным OVA штаммом Lm (8000 КОЕ).Присутствие SIINFEKL-специфических эффекторных клеток в селезенке оценивали с помощью анализов ELISPOT через 7 дней. Мы обнаружили, что SIINFEKL-специфические эффекторные Т-клетки стимулировались у Lm-иммунных животных, впоследствии иммунизированных рекомбинантным OVA-экспрессирующим штаммом Lm, и частота пептид-специфических клеток, обнаруженная с помощью ELISPOT, согласуется с количеством клеток, обнаруженных после первичный ответ у наивных животных (рис. 1, , правая панель, ). Кроме того, когда обе иммунизации выполняются штаммом Lm, экспрессирующим OVA, наблюдается резкое численное увеличение количества SIINFEKL-специфических эффекторных клеток, согласующихся с ответом памяти.Результаты этих экспериментов подтверждают наши предыдущие открытия (27) и расширяют наблюдения о том, что существующий антилистериальный иммунитет не препятствует стимуляции эффекторных клеток вновь представленными Lm-производными Ag в особой линии мышей.

Существующий антистериальный иммунитет не влияет на примирование вновь экспрессированного Lm-производного Ag после вторичной инфекции. Левая панель. , мышей C57BL / 6 иммунизировали ~ 800 КОЕ Lm.Двадцать восемь дней спустя этим мышам вводили ~ 8000 КОЕ экспрессирующего SIINFEKL штамма Lm в качестве вторичной дозы, и в указанные дни (пунктирная линия) определяли log ₁₀ КОЕ на селезенку. Отдельная группа животных получала ~ 800 КОЕ экспрессирующего SIINFEKL штамма Lm в качестве первичной инфекции (сплошная линия), и log ₁₀ КОЕ на селезенку определяли одновременно. Правая панель. , мышей C57BL / 6 иммунизировали ~ 800 КОЕ Lm. Двадцать восемь дней спустя этим мышам вводили ~ 8000 КОЕ штамма Lm, экспрессирующего SIINFEKL (Lm-OVA), в качестве вторичной дозы, а через 7 дней — количество SIINFEKL-секретирующих IFN-γ клеток, присутствующих в селезенке. популяцию клеток определяли с помощью ELISPOT.Контроли включают мышей, которым один раз инъецировали Wt, один раз — экспрессирующий SIINFEKL штамм Lm, или животных, которым дважды инъецировали SIINFEKL-экспрессирующий штамм Lm. Данные представляют два независимых эксперимента.

Чтобы определить, была ли противоопухолевая эффективность SIINFEKL-специфических эффекторных клеток, стимулированных в качестве первичного ответа у мышей, изменена существующим антилистериальным иммунитетом, мышей иммунизировали Lm, а через 23 дня этим Lm-иммунным мышам вводили OVA-экспрессирующие опухолевые клетки меланомы. (B16-MO5).Через пять дней мышей с опухолью иммунизировали Wt OVA-экспрессирующим вакцинным штаммом Lm. Положительные контроли включают Lm-наивных мышей с опухолями, которым инъецировали OVA-экспрессирующий штамм Lm, а отрицательные контроли включали мышей, иммунизированных родительским векторным штаммом Lm, инфузированных опухолевыми клетками, а затем снова инъецированных родительским векторным штаммом Lm. Легкие у экспериментальных и контрольных мышей собирали через 14 дней (19 дней после инфузии опухолевых клеток) и подсчитывали количество метастазов в легких.Данные, представленные в Таблице III⇓, показывают, что опухолевое бремя у животных с Lm-иммунными опухолями, которым вводили вакцинный штамм, значительно снижено, а количество легочных метастазов эквивалентно контрольной группе, несущей опухоль, иммунизированной вакциной (в среднем 12 ± 10 и 10 ± 10 опухолевых узлов). Не наблюдается снижения опухолевой нагрузки в группе мышей, получивших первичную и вторичную инъекции Wt Lm, что дает дополнительные доказательства того, что уменьшение опухоли является функцией специфического, а не неспецифического воспаления.Для показанных исследований вторичная доза Lm, экспрессирующего OVA (8000 КОЕ), была в 10 раз больше, чем доза первичной иммунизации Wt (800 КОЕ). Мы также определили, что после вторичной иммунизации штаммом Lm, экспрессирующим OVA, с дозой, которая в 10 раз меньше (800 КОЕ), противоопухолевые ответы на вновь экспрессированные опухолевые мишени неотличимы от положительных контролей (данные не показаны). Однако противоопухолевые ответы менее очевидны после вторичной иммунизации более низкими дозами, такими как 80 КОЕ (данные не показаны).Вывод из этих экспериментов состоит в том, что существующий антилистериальный (противовоспалительный) иммунитет не влияет на развитие терапевтических пептид-специфичных CD8 ⁺ Т-клеток после вторичной иммунизации рекомбинантным вакцинным штаммом Lm, экспрессирующим вновь доставленную антигенную мишень.

Существующий антилистический иммунитет не является препятствием для использования Lm в качестве терапевтической рекомбинантной вакцины

Lm, экспрессирующий опухоль меланомы TRP-2 Ag

Результаты, описанные выше, демонстрируют 1) терапевтическую эффективность ослабленного вирулентностью рекомбинантного Lm в качестве противоопухолевой вакцины, 2) лечение антибиотиками не снижает терапевтический противоопухолевый ответ после иммунизации рекомбинантным Lm, и 3) существующий антилистический иммунитет не изменяет вакцину. векторная эффективность Lm в модельной опухолевой системе Ag.Чтобы определить, можно ли распространить эти наблюдения на эндогенную опухоль-мишень, мы использовали рекомбинантный штамм Lm, экспрессирующий область мышиного TRP-2, которая включает представленный MHC класс I целевой пептид TRP-2 (а.о. 180–188) в качестве вакцина для развития противомеланомного иммунитета. (Развитие и характеристика этого рекомбинантного штамма Lm подробно описаны в другом месте. ⁴ )

Иммунизация штаммом Lm, экспрессирующим TRP-2 (Lm-TRP-2), приводит к стимуляции TRP-2-специфических ответов, и в трех независимых экспериментах ответ TRP-2 колеблется от 46 до 77 IFN-γ- секретирующих клеток на 100 000 иммунных клеток.Штамм Lm-TRP-2 также экспрессирует детерминанту NP LCMV, и после иммунизации ответ NP составляет от 80 до 115 IFN-γ-секретирующих клеток на 100000 иммунных клеток. В соответствии с предыдущим открытием, ⁴ эти результаты показывают, что Lm, экспрессирующий TRP-2, стимулирует развитие TRP-2-специфических CD8 ⁺ Т-клеток.

Чтобы определить, распознают ли TRP-2-специфические клетки опухолевые клетки меланомы, анализы ELISPOT проводили с TRP-2-специфическими эффекторными клетками и клетками меланомы B16-MO5 в качестве мишени.Чтобы получить TRP-2, LCMV NP, SIINFEKL или gp100 (другая эндогенная опухоль меланомы Ag (28, 29)) — специфические эффекторные клетки для этих экспериментов, мышей иммунизировали штаммами, экспрессирующими TRP-2 или OVA. Lm или вакцинационная конструкция плазмидной ДНК, экспрессирующая gp100, и 10 дней спустя иммунные клетки селезенки независимо стимулировали сокультивированием с TRP-2-, LCMV NP-, SIINFEKL- или нормальными клетками селезенки, обработанными пептидом gp100, в качестве APC. Клетки культивировали в течение 6 дней, и цикл стимуляция-культивирование повторяли.Клетки собирали через 6 дней после начала второго цикла культивирования и использовали в качестве индикаторных клеток в анализах ELISPOT. Поскольку клетки меланомы также экспрессируют OVA, ответы на пептид-мишень SIINFEKL, представленный MHC класса I, также должны быть очевидны. Мы обнаружили, что TRP-2-специфические эффекторные клетки секретируют IFN-γ после взаимодействия с опухолевыми клетками меланомы, и эффективность распознавания аналогична таковой для SIINFEKL- или gp100-специфичных эффекторных клеток, с ~ 90 пятен, обнаруженных на 125 входных эффекторов клетки.Эффекторные клетки, специфичные к NP LCMV, не секретируют IFN-γ после взаимодействия с клетками меланомы. Эти результаты демонстрируют, что TRP-2-специфические клетки, первоначально стимулированные у животных, иммунизированных Lm-TRP-2, обладают эффекторной функцией (секретируют IFN-γ) после сокультивирования с опухолевыми клетками меланомы.

Чтобы определить, обладают ли TRP-2-специфические клетки противоопухолевой активностью in vivo, мышей C57BL / 6 иммунизировали штаммом Lm-TRP-2, клетки селезенки получали и стимулировали сокультивированием с APC, подвергнутым импульсному облучению TRP-2 пептидом, в течение 6 дней. как описано ранее.После второго цикла стимуляции восстановленные клетки адоптивно переносили в количестве 8 × 10 ⁶ / реципиентов животным, которым инъецировали клетки меланомы 5 дней назад (таблица IV⇓). Через четырнадцать дней после переноса Т-клеток животных умерщвляли и подсчитывали количество метастазов в легких. Легкие необработанных контрольных животных содержали> 250 легочных метастазов, в то время как реципиенты TRP-2-специфических эффекторных клеток содержали от 0 до 11 (в среднем 3 ± 3) легочных метастазов.(Ответы de novo не возникают в результате стимуляции in vitro, поскольку реципиенты наивных клеток, которые были стимулированы в течение 2 циклов культивирования целевым пептидом TRP-2, не показывают снижения уровня опухолевой нагрузки (данные не показаны). Реципиенты «положительного» контроля SIINFEKL-специфических клеток также содержали заметно уменьшенное количество легочных метастазов (среднее 29 ± 26). Это различие в терапевтической эффективности может быть связано с гетерогенной экспрессией OVA на клетках B16-MO5, в то время как эндогенный TRP-2 Ag имеет более гомогенную экспрессию.У реципиентов отрицательного контроля, специфичных к NP LCMV эффекторных клеток, не наблюдается снижения уровня опухолевой нагрузки. Эти результаты показывают, что TRP-2-специфические эффекторные клетки могут опосредовать регресс установленных легочных метастазов и что регрессионный ответ является пептид-специфическим.

TRP-2-специфические эффекторные клетки опосредуют регресс установленных легочных метастазов

Чтобы определить, приводит ли иммунизация Lm-TRP-2 к стимуляции долгоживущей или противоопухолевой защиты памяти, мышей C57BL / 6 сначала иммунизировали штаммом Lm-TRP-2, а затем через 3 недели заражали опухолевыми клетками меланомы B16. .Через 20 дней легкие удалили и подсчитали количество метастазов. В соответствии с более ранними результатами, ⁴ , мы обнаружили, что количество легочных метастазов было заметно снижено в группе, иммунизированной Lm-TRP-2, по сравнению с группой, не несущей наивную опухоль (данные не показаны). Чтобы определить, можно ли успешно использовать вакцинный штамм Lm-TRP-2 в терапевтических целях, мышам вводили клетки меланомы B16-MO5, а затем через 5 дней иммунизировали штаммом Lm-TRP-2.В качестве положительного контроля группу мышей с опухолью иммунизировали штаммом Lm, экспрессирующим OVA. Данные, представленные на фиг. 2⇓, показывают, что группа, иммунизированная штаммом Lm-TRP-2, имела ограниченное количество метастазов в легкие, при этом снижение опухолевой нагрузки по величине аналогично группе положительного контроля (животные, иммунизированные штаммом, экспрессирующим OVA, штамм Lm). Эти показанные данные о легких являются репрезентативными для результатов, полученных в идентичных экспериментах, при этом количество метастазов составляет 3, 5, 20 и 53 для животных, иммунизированных Lm-TRP-2.Эти результаты четко подтверждают терапевтический потенциал штамма Lm, экспрессирующего TRP-2, и то, что TRP-2-специфические эффекторные клетки, стимулированные после иммунизации, являются клинически функциональными.

Рекомбинантный Lm-экспрессирующий TRP-2 стимулирует терапевтические противоопухолевые ответы. Мышам C57BL / 6 внутривенно вводили 7 × 10 ⁵ OVA-экспрессирующих клеток меланомы B16 и через 5 дней иммунизировали либо ∼0,1 LD ₅₀ штамма Lm-TRP-2, либо штамма Lm-OVA (положительный результат контроль).Через девятнадцать дней после инъекции опухоли легкие удаляли и определяли уровни опухолевой нагрузки. Количество метастазов в легких накладывается на каждый образец легкого.

Существующий антилистический иммунитет и стимуляция противоопухолевых ответов после иммунизации штаммом Lm, экспрессирующим TRP-2

Чтобы определить, может ли иммунизация вакцинным штаммом Lm-TRP-2 стимулировать терапевтические противоопухолевые ответы у Lm (противовоспалительных) животных, мышей C57BL / 6 иммунизировали Wt Lm, а затем 28 дней спустя инъецировали клетки меланомы.Через пять дней этих животных иммунизировали штаммом Lm-TRP-2. Через девятнадцать дней после заражения опухолью (14 дней после вторичной иммунизации Lm-TRP-2) животных умерщвляли, удаляли легкие и подсчитывали количество легочных метастазов. Группа положительного контроля включала мышей с опухолью, которым была проведена терапевтическая первичная иммунизация штаммом Lm-TRP-2, а группа отрицательного контроля включала животных, несущих опухоль Lm (векторно-иммунные), которым была сделана вторичная инъекция Lm.Терапевтическая эффективность вакцинного штамма Lm-TRP-2 полностью сохранялась в присутствии существующего антистериального иммунитета (рис. 3⇓ и таблица V⇓). Уровень опухолевой нагрузки у животных-носителей опухоли с антилистическим иммунитетом, которым была проведена вторичная иммунизация штаммом Lm TRP-2 (в среднем 7 ± 12 опухолевых узлов), аналогичен по величине уровню опухолевой нагрузки у животных-опухоленосителей, получавших терапевтическая первичная инъекция Lm-TRP-2 (в среднем 5 ± 6 опухолевых узлов). Таким образом, даже несмотря на то, что Lm быстро выводится после вторичной инъекции из-за существующего антистериального ответа, иммунологические сигналы, необходимые для примирования / стимуляции «собственных» -TRP-2-реактивных клеток, не изменяются, и эти TRP-2-реактивные клетки способны для движения к месту опухоли и опосредования регрессии опухоли.Можно снова отметить, что неспецифические события, возникающие в результате инъекции Lm, не способствуют эрадикации опухоли, поскольку уровень опухолевой нагрузки у животных с иммунной опухолью Lm, получавших вторичную инъекцию Lm, аналогичен по величине нормальному опухолевому заболеванию. Несущая контрольная группа.

Терапевтические противоопухолевые реакции, специфичные для TRP-2, стимулируются у животных с существующим антистериальным иммунитетом. Мышей C57BL / 6 иммунизировали ~ 800 КОЕ родительского векторного штамма Lm.Двадцать три дня спустя животным вливали клетки меланомы B16, а затем через 5 дней иммунизировали штаммом Lm-TRP-2 (Lm-TRP-2-иммунизированные Lm-иммунные мыши, несущие опухоль). Контроли включают Lm-иммунизированных Lm-иммунных мышей, несущих опухоль, и иммунизированных Lm-TRP-2 животных, несущих опухоль. Для всех групп через 19 дней после инфузии опухолевых клеток легкие удаляли и подсчитывали уровни опухолевой нагрузки. Количество метастазов в легких накладывается на каждый образец легкого.

Существующий антилистический иммунитет не является препятствием для использования Lm в качестве терапевтической рекомбинантной вакцины

Обсуждение

Вакцинные стратегии против рака основаны на требовании, чтобы вакцина доставляла достаточный стимул, чтобы можно было инициировать опухолеспецифический ответ и развитие опухолеспецифических эффекторных клеток, которые будут взаимодействовать с опухолевой клеткой, приводя к ее разрушению. .В отличие от профилактических бактериальных вакцин, в которых иммуноген является экзогенным бактериальным продуктом, стимуляция иммунного ответа на опухоль проблематична, поскольку в большинстве случаев ответ специфичен для ассоциированного с опухолью само-Ag; большинство белков или Ag, экспрессируемых опухолями, можно найти где-нибудь в организме хозяина. Таким образом, дополнительным требованием к противораковой вакцине является необходимость обеспечения достаточного стимула для преодоления регуляторных сетей, которые могут существовать для контроля или ограничения анти-самонаправленных реакций.Мы сделали наблюдение на модели меланомы мыши, что когда Lm-экспрессирующий TRP-2 используется в качестве вектора вакцины для доставки TRP-2 «собственного опухолевого Ag», развиваются CD8 ⁺ Т-клетки, которые являются TRP-2-специфичными. и обладают терапевтическим действием против установленных метастазов в легких. Обнаружение того, что ответ на собственный опухолевый Ag может быть инициирован с использованием Lm в качестве вектора доставки Ag в сочетании с наблюдением, что стимулированные клетки являются терапевтическими, является важным и необходимым первым шагом для продолжения развития Lm в качестве вектора вакцины.

Для успешного клинического применения Lm в качестве рекомбинантной вакцины необходимо решить различные проблемы безопасности. Скорее всего, будут использоваться мутантные штаммы с ослабленной вирулентностью, чтобы минимизировать потенциальную инфекционную природу патогена. Несмотря на снижение вирулентности, ослабленные штаммы Lm сохраняют способность стимулировать защитный антилистический иммунитет даже при дозах на порядки ниже LD ₅₀ (30). Более того, аттенуированные штаммы показали эффективность в стимуляции защитного антистериального иммунитета у хозяев с ослабленным иммунитетом, таких как мыши с нокаутом IFN-γ (31).В текущем исследовании, хотя вирулентность снижена для аттенуированных штаммов, пептид-специфические эффекторные клетки CD8 ⁺ развиваются и функционируют в условиях терапевтической модели меланомы, обеспечивая дополнительную поддержку вакцинного потенциала аттенуированных штаммов Lm. Недавно нормальные добровольцы, получившие пероральную дозу аттенуированного штамма L. monocytogenes (дефект межклеточного распространения) в ходе клинических испытаний фазы I, показали, что Lm хорошо переносится без каких-либо нежелательных побочных эффектов (32).

Системное использование живой аттенуированной вакцины Lm можно легко контролировать (при необходимости) с помощью антибиотиков. Предыдущие сообщения показывают, что лечение антибиотиками через 24–48 часов после иммунизации Lm не снижает стимуляции антистериальных эффекторных клеток (26). Мы подтвердили этот вывод, и в этом отчете показано, что терапевтический потенциал противоопухолевой вакцины Lm не изменяется и не уменьшается после лечения антибиотиками. Способность ограничивать инфекционную природу Lm как вакцинного вектора либо путем ослабления вирулентности, либо с помощью антибиотикотерапии без потери терапевтической эффективности, решительно поддерживает дальнейшее развитие платформы этой противораковой вакцины.

Дополнительный параметр для разработки рекомбинантных вакцин на основе Lm связан с наблюдаемыми преимуществами в зависимости от неспецифических и специфических эффектов, поскольку L. monocytogenes явно является мощным стимулятором воспалительных процессов. Сообщалось о противоопухолевых ответах, которые носят исключительно неспецифический характер, что подтверждается данными, показывающими регресс солидной опухоли, а также метастатическое заболевание легких после иммунизации контрольными штаммами Lm (13).Неспецифический характер противоопухолевых ответов подтверждается данными, демонстрирующими сходные закономерности высвобождения воспалительных цитокинов после инфицирования рекомбинантным Lm по сравнению с инфицированием контрольными Lm. В наших исследованиях уменьшение опухоли происходило только в том случае, если опухолеспецифический иммунный ответ развивался после иммунизации рекомбинантными вакцинами Lm, экспрессирующими определенный Ag (фиг. 3⇑ и таблицы I⇑, III⇑ и V⇑). Отсутствие неспецифического уменьшения опухоли в наших исследованиях может быть частично связано с природой рекомбинантных штаммов Lm, используемых в качестве иммуногена, дозами, которые использовались для иммунизации (низкие или высокие), или линией B16, использованной для модели опухоли в данном исследовании. изучение.

Инъекция Lm наивным мышам приводит к неконтролируемой репликации бактерий в течение первых 72 часов, после чего количество КОЕ в селезенке начинает снижаться. Через шесть дней после инъекции селезеночные КОЕ практически отсутствуют, опосредованные провоспалительными CD4 ⁺ Т-клетками и защитными ответами CD8 ⁺ CTL (4, 9). Это открытие резко контрастирует с клиренсом Lm из селезенки иммунных животных. К 72 часам после заражения количество КОЕ в селезенке обычно ниже пределов обнаружения (33).Как правило, быстрый иммуноопосредованный клиренс вектора предотвращает его повторное использование в клинических условиях. Таким образом, при рассмотрении Lm в качестве носителя вакцины ключевой вопрос заключается в том, есть ли достаточно времени для стимуляции первичного ответа на интересующий рекомбинантный Ag, учитывая узкое окно, в котором можно ожидать, что вектор сохранится в среде существующего противовоспалительного средства. иммунитет.

Поскольку клиренс Lm в первую очередь является клеточно-опосредованным событием, а нейтрализация Ab не играет практически никакой роли в его клиренсе, повторная иммунизация должна быть возможна.Наши предыдущие исследования показали, что этот быстрый клиренс (короткое время воздействия) Lm как следствие существующего антистериального иммунитета не препятствует стимуляции повторных ответов на пептиды, производные Lm, а существующий антилистический иммунитет не препятствует развитию CD8 ⁺ Т-клеточных ответов. к вновь экспрессируемым агентам, содержащимся в качестве компонента вторичной иммунизации (27). В этом отчете мы распространяем эти результаты на дополнительные детерминанты, пептид SIINFEKL OVA и собственный пептид TRP-2, и подтверждаем, что реакции на праймирование и ответы на воспоминания могут происходить независимо и одновременно.Способность инициировать клеточный иммунный ответ против собственного пептида в среде существующего противовоспалительного иммунитета показывает, что быстрый клиренс рекомбинантного Lm после вторичного воздействия не уменьшает природу или силу воспалительных сигналов, которые позволяют стимулировать CD8 ⁺ ответ против самообразованного Ag. Наши результаты подтверждаются исследованиями, показывающими, что Т-клетки CD8 ⁺ активируются и пролиферируют после кратковременного (всего 2 часа) воздействия пептида плюс MHC (34, 35).В качестве дополнительного подтверждения наших результатов было показано, что у мышей с существующими ЦТЛ, специфичными для NP пептида гриппа (ограниченные h3-K ^d ), развиваются ответы, ограниченные h3-K ^d , и ответы, ограниченные h3-L ^d . после иммунизации рекомбинантным вирусом осповакцины, который кодирует пептид гриппа, а также дополнительные целевые пептиды CTL (36). В этих экспериментах существующий иммунитет присутствует как противогриппозный ответ. Присутствие существующих противогриппозных CTL не изменяет начальную инфекцию осповакцины или примирования дополнительных пептидов, представленных тем же ограничивающим элементом MHC класса I, а также примирования к пептидам-мишеням CTL, представленным отдельными ограничивающими элементами MHC класса I.Специфический ответ на NP гриппа усиливался после бустерной инъекции, что дополнительно демонстрирует, что первичные эффекторные ответы CD8 ⁺ и ответы воспоминаний могут происходить независимо и одновременно. Исследования антибиотиков дополнительно подтверждают тот факт, что относительно короткое воздействие Lm на хозяина достаточно для запуска функционального клеточного иммунного ответа.

Хотя наши данные, представленные в таблицах III⇑ и V⇑ и на рис. 3⇑, подтверждают предположение о том, что существующий противовоспалительный иммунитет не является препятствием для терапевтической эффективности Lm в качестве рекомбинантной вакцины, сообщалось о данных, которые не согласуются с нашими оригинальная находка (37).В этом исследовании ранее существовавший антистериальный иммунитет, по-видимому, ингибировал прайминг к вновь экспрессируемым детерминантам, полученным из Lm, которые были доставлены после вторичной инфекции. Возможное объяснение этих различных результатов можно найти в дозе Lm, используемой для вторичных инфекций. Количество Lm КОЕ, использованное для вторичной инъекции, в наших исследованиях составляет ∼8000 КОЕ. Напротив, для исследования, в котором не удалось выявить прайминг в среде существующего антистериального иммунитета, для вторичного инъекционного инокулята использовалась доза Lm ~ 100000 КОЕ.Таким образом, похоже, что успех первичного события к новому детерминанту может быть связан с величиной вторичной инфекции. Используя тетрамерный анализ пептид-специфических Т-клеток CD8 ⁺ , следующих за вторичным Lm, было показано, что величина последующего ответа обратной связи обратно пропорциональна уровню дозы вторичной инфекции (19), таким образом добавляя некоторую поддержку для представление о том, что неизвестные события, происходящие при более высоких дозах инфекции, могут быть не самыми благоприятными для стимуляции иммунных ответов ни на уровне прайминга, ни на уровне ответа клетки памяти / отзыва.Мы продолжаем эксперименты на модели опухоли меланомы, чтобы более подробно оценить это явление.

Недавнее исследование показало регресс солидных опухолей B16F10, экспрессирующих NP гриппа, после иммунизации штаммом Lm, экспрессирующим тот же NP Ag гриппа (13). Интересной особенностью этого исследования было то, что повторные иммунизации экспрессирующим грипп штаммом Lm, по-видимому, не принесли дополнительных преимуществ в этой модели. Для объяснения этого открытия быстрый клиренс Lm у иммунных животных рассматривался как вероятный механизм, который может предотвратить дальнейшую стимуляцию или размножение NP-специфичных эффекторных клеток гриппа.Эта интерпретация предполагает, что это событие быстрого выведения может ограничивать эффективность или повторное использование Lm в качестве рекомбинантной вакцины. Однако эта интерпретация, по-видимому, не согласуется со многими исследованиями, которые продемонстрировали численное увеличение популяций эффекторных клеток после вторичной инфекции Lm (38). Возможно, что эти результаты могут быть объяснены на основе использования рекомбинантного вакцинного штамма Lm, в котором интересующей детерминантой является плазмида, а не геномно кодируется.Для исследований, оценивающих стимуляцию и терапевтическую пользу NP-специфических ответов гриппа, NP гриппа кодировались плазмидой, что допускало потенциальную потерю плазмиды in vivo. В исследованиях, представленных в этом отчете, гетерологичная детерминанта была геномной, что уменьшало беспокойство по поводу потери экспрессии in vivo.

Таким образом, данные, представленные в этом отчете, показывают два важных вывода об использовании Lm в качестве вектора противораковой вакцины в клинических условиях. Во-первых, в терапевтической модели меланомы использование штаммов с ослабленной вирулентностью в качестве вектора вакцины или антибиотикотерапия для ограничения инфекции после иммунизации не снижает способность рекомбинантного Lm стимулировать противоопухолевые ответы.Во-вторых, в отличие от вирусных векторов, таких как коровья оспа или аденовирус, повторные инъекции Lm иммуноусиливают и, по-видимому, не ограничивают продолжающееся развитие первичных эффекторных клеток CTL. Что важно и в условиях терапевтической модели, прайминг-ответ, очевидный после иммунизации, может развиваться против детерминанты, полученной самостоятельно. Эти данные подтверждают продолжающуюся оценку Lm как вектора доставки вакцины.

Сноски

• №1 Работа выполнена при финансовой поддержке фонда Veterans Affairs Merit Review AI44376 (H.G.A.B.), AI45025 (для H.S.), CA84008 (для J.F.M.), грант Национального института здравоохранения по предокторной генетике (для K.W.B.) и Cerus Corporation (для D.B., T.D. и M.G.).

• ↵2. Запросы на переписку и перепечатку направляйте доктору Х. Г. Арчи Баууэру, Immunology Research, RD41, 3710 Southwest U.S. Veterans Hospital, Veterans Affairs Medical Center, Portland, OR 97201. Адрес электронной почты: bouwera {at} ohsu.edu.

• ↵3 В данной статье использованы сокращения: Lm, Listeria monocytogenes ; LCMV, вирус лимфоцитарного хориоменингита; NP, нуклеопротеин; ЛЛО, листериолизин О; TRP-2, белок 2, родственный тирозиназе; Wt, дикий тип.

• №4 К. В. Брун, Б. Д. Нгуен, Н. Крафт, Дж. Йип, А. Де, С. С. Гамбхир и Дж. Ф. Миллер. Стимуляция Т-клеточного ответа против собственного CD8 и защита опухоли после иммунизации рекомбинантным Listeria monocytogenes , экспрессирующим мышиный антиген меланомы TRP-2. Подана к публикации .

• Получено 30 января 2004 г.
• Принято 19 апреля 2004 г.

• Авторское право © 2004 Американская ассоциация иммунологов

Ссылки

1. ↵

   Хан, Х., С. Х. Э. Кауфманн. 1981. Роль клеточно-опосредованных в бактериальных инфекциях. Rev. Infect. Дис. 3: 1221.

2. ↵

   Портной Д.А. 1992. Врожденный иммунитет к факультативному внутриклеточному бактериальному патогену. Curr. Opin. Иммунол. 4:20.

3. ↵

   Портной Д.А., Чакраборти Т., Гебель В., Коссарт П. 1992. Молекулярные детерминанты патогенеза Listeria monocytogenes. Заразить. Иммун.60: 1263.

4. ↵

   Болдридж, Дж. Р., Р. А. Барри, Д. Дж. Хинрикс. 1990. Выражение системной защиты и гиперчувствительности замедленного типа к Listeria monocytogenes опосредуется различными субпопуляциями Т-клеток. Заразить. Иммун. 58: 654.

5. ↵

   Кауфманн, С. Х., Э. Хуг, У. Ват, Л. Де. 1987. Специфический лизис Listeria monocytogenes -инфицированных макрофагов рестриктированными классом II L3T4 ⁺ Т-клетками.Евро. J. Immunol. 17: 237.

6. ↵

   Кауфманн, С. Х .. 1987. Возможная роль хелперных и цитолитических Т-лимфоцитов в антибактериальной защите: выводы, основанные на мышиной модели листериоза. Rev. Infect. Дис. 9: (Дополнение 5) : S650.

7. ↵

   Епископ Д. К., Д. Дж. Хинрикс. 1987. Принятая передача иммунитета к Listeria monocytogenes : влияние стимуляции in vitro на потребности подгруппы лимфоцитов.J. Immunol. 139: 2005.

8. ↵

   Харти, Дж. Т., Э. Г. Памер. 1995. CD8 Т-лимфоциты, специфичные к секретируемому антигену p60, защищают от инфекции Listeria monocytogenes . J. Immunol. 154: 4642.

9. ↵

   Харти, Дж. Т., М. Дж. Беван. 1992. CD8 ⁺ Т-клетки, специфичные к одному неамерному эпитопу Listeria monocytogenes , являются защитными in vivo. Дж.Exp. Med. 175: 1531.

10. ↵

    Шен, Х., М. К. Слифка, М. Матлобиан, Э. Р. Йенсен, Р. Ахмед, Дж. Ф. Миллер. 1995. Рекомбинантный Listeria monocytogenes в качестве носителя живой вакцины для индукции защитного противовирусного клеточного иммунитета. Proc. Natl. Акад. Sci. США 92: 3987.

11. ↵

    Дженсен, Э. Р., Х. Шен, Ф. О. Веттштейн, Р. Ахмед, Дж. Ф. Миллер. 1997. Рекомбинантный Listeria monocytogenes в качестве носителя живой вакцины и зонда для изучения клеточно-опосредованного иммунитета.Иммунол. Откр. 158: 147.

12. ↵

    Пан, З.-К., Г. Икономидис, А. Лазенби, Д. Пардолл, Ю. Патерсон. 1995. Рекомбинантная вакцина Listeria monocytogenes , экспрессирующая модельный опухолевый антиген, защищает мышей от заражения летальными опухолевыми клетками и вызывает регрессию сформировавшихся опухолей. Nat. Med. 1: 471.

13. ↵

    Пан, З.-К., Л. М. Вейскирх, Ю. Патерсон. 1999. Регрессия установленной меланомы B16F10 с помощью рекомбинантной вакцины Listeria monocytogenes .Cancer Res. 59: 5264.

14. ↵

    Ганн, Г. Р., А. Зубайр, К. Петерс, З.-К. Пан, Т.-К. Ву, Ю. Патерсон. 2001. Два вакцинных вектора Listeria monocytogenes , которые экспрессируют различные молекулярные формы E7 вируса папилломы человека-16 (ВПЧ-16), индуцируют качественно разный Т-клеточный иммунитет, который коррелирует с их способностью вызывать регресс уже сформировавшихся опухолей, иммортализованных ВПЧ-16. J. Immunol. 167: 6471.

15. ↵

    Мурата, К., А. Гарсиа-Састре, М. Цуджи, М. Родригес, Д. Родригес, Х. Р. Родригес, Р. С. Нуссенцвейг, П. Палезе, М. Эстебан, Ф. Завала. 1996. Характеристика in vivo первичных и вторичных CD8 ⁺ Т-клеточных ответов, индуцированных рекомбинантными вирусами гриппа и коровьей оспы. Клетка. Иммунол. 173: 96.

16. ↵

    Кундиг, Т. М., К. П. Кальберер, Х. Хенгартнер, Р. М. Цинкернагель. 1993. Вакцинация двумя разными рекомбинантными вирусами осповакцины: длительное ингибирование вторичной вакцинации.Вакцина 11: 1154.

17. ↵

    Скария, А., Дж. А. Сент-Джордж, Р. Дж. Грегори, Р. Дж. Ноэль, С. К. Уодсворт, А. Е. Смит, Дж. М. Каплан. 1997. Антитело к лиганду CD40 ингибирует как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ на аденовирусные векторы и облегчает повторное введение в дыхательные пути мыши. Gene Ther. 4: 611.

18. ↵

    Кей, М. А., Л. Мёз, А. М. Гоун, П. Линсли, Д. Холленбо, А.Аруффо, Х. Д. Охс, К. Б. Уилсон. 1997. Временная иммуномодуляция антителом к ​​лиганду CD40 и CTLA4Ig усиливает персистентность и опосредованный вторичным аденовирусом перенос гена в печень мыши. Proc. Natl. Акад. Sci. США 94: 4686.

19. ↵

    Поуп К., С. К. Ким, А. Марзо, К. Уильямс, Дж. Цзян, Х. Шен, Л. Лефрансуа. 2001. Орган-специфическая регуляция ответа CD8 Т-клеток на инфекцию Listeria monocytogenes . Дж.Иммунол. 166: 3402.

20. ↵

    Брандейдж, Р. А., Г. А. Смит, А. Камилли, Дж. А. Териот, Д. А. Портной. 1993. Экспрессия и фосфорилирование белка ActA Listeria monocytogenes в клетках млекопитающих. Proc. Natl. Акад. Sci. США 90: 11890.

21. ↵

    Гломски, И. Дж., М. М. Гедде, А. В. Цанг, Дж. А. Свонсон, Д. А. Портной. 2002. Гемолизин Listeria monocytogenes имеет кислый оптимум pH для разделения активности и предотвращения повреждения инфицированных клеток-хозяев.J. Cell Biol. 156: 1029.

22. ↵

    Лауэр П., М. Ю. Н. Чоу, М. Дж. Лесснер, Д. А. Портной, Р. Календер. 2002. Конструирование, характеристика и использование двух сайт-специфичных векторов интеграции фага Listeria monocytogenes . J. Bacteriol. 184: 4177.

23. ↵

    Барри Р. А., Х. Г. А. Бауэр, Т. Кларк, К. А. Корнелл, Д. Дж. Хинрикс. 2003. Защита мышей с нокаутом интерферона γ от контрольного заражения Listeria monocytogenes после внутримышечной иммунизации ДНК-вакцинами, кодирующими листериолизин О.Вакцина 21: 2122.

24. ↵

    Саймон Б. Э., К. А. Корнелл, Т. Р. Кларк, С. Чоу, Х. Розен, Р. А. Барри. 2004. ДНК-вакцинация защищает мышей от заражения Listeria monocytogenes , экспрессирующим белок NS3 вируса гепатита С. Заразить. Иммун. 71: 6372.

25. ↵

    Мандл, С., Л. Дж. Сигал, К. Л. Рок, Р. Андино. 1998. Векторы вакцины против полиовируса вызывают антиген-специфические цитотоксические Т-клетки и защищают мышей от летального заражения клетками злокачественной меланомы, экспрессирующими модельный антиген.Proc. Natl. Акад. Sci. США 95: 8216.

26. ↵

    Mercado, R., S. Vijh, S. E. Allen, K. M. Kerksiek, E. G. Pamer. 2000. Раннее программирование популяций Т-клеток, реагирующих на бактериальную инфекцию. J. Immunol. 165: 6833.

27. ↵

    Бауэр, Х. Г. А., Х. Шен, Х. Фан, Дж. Ф. Миллер, Р. А. Барри, Д. Дж. Хинрикс. 1999. Существующий антилистический иммунитет не подавляет развитие специфического для Listeria monocytogenes ответа первичных цитотоксических Т-лимфоцитов.Заразить. Иммун. 67: 253.

28. ↵

    Чжай Ю., Дж. К. Ян, П. Списс, М. И. Нишимура, В. В. Овервейк, Б. Робертс, Н. П. Рестифо, С. А. Розенберг. 1997. Клонирование и характеристика генов, кодирующих мышиные гомологи антигенов меланомы человека MART1 и gp100. J. Immunother. 20:15.

29. ↵

    Schreurs, M. W. J., A. J. de Boer, A. Schmidt, C. G. Figdor, G. J. Adema.1997. Клонирование, экспрессия и тканевое распределение мышиного гомолога меланоцитарного клон-специфического антигена gp100. Melanoma Res. 7: 463.

30. ↵

    Барри, Р. А., Х. Г. А. Бауэр, Д. А. Портной, Д. Дж. Хинрикс. 1992. Патогенность и иммуногенность Listeria monocytogenes мутантов малых бляшек, дефектных по внутриклеточному росту и межклеточному распространению. Заразить. Иммун. 60: 1625.

31. ↵

    Харти, Дж.Т., М. Дж. Беван. 1995. Специфический иммунитет к Listeria monocytogenes в отсутствие IFN γ. Иммунитет 3: 109.

32. ↵

    Ангелакопулос, Х., К. Лок, Д. М. Сисул, Э. Р. Йенсен, Дж. Ф. Миллер, Э. Л. Хоманн. 2002. Безопасность и выделение ослабленного штамма L. monocytogenes с делецией actA / plcB у взрослых добровольцев: исследование повышения дозы пероральной инокуляции. Заразить. Иммун. 70: 3592.

33. ↵

    Бауэр, Х. Г. А., Р. А. Барри, Д. Дж. Хинрикс. 1997. Приобретенный иммунитет к внутриклеточному патогену: иммунологическое распознавание клеток, инфицированных L. monocytogenes . Иммунол. Откр. 158: 137.

34. ↵

    Мурали-Кришна, К., Р. Ахмед. 2000. Наивные Т-клетки, маскирующиеся под клетки памяти. J. Immunol. 165: 1733.

35. ↵

    Вонг, П., Э. Г. Памер. 2001. Антиген-независимая пролиферация Т-лимфоцитов CD8. J. Immunol. 166: 5864.

36. ↵

    Шеррит, М. А., Дж. Гарднер, С. Л. Эллиот, К. Шмидт, Д. Парди, Г. Делияннис, В. Р. Хит, А. Зурбье. 2000. Влияние существующих цитотоксических Т-лимфоцитов на терапевтические вакцины. Евро. J. Immunol. 30: 671.

37. ↵

    Vijh, S., I.M. Pilip, E.G. Pamer. 1999. Неконкурентная экспансия цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных для разных антигенов, при бактериальной инфекции.Заразить. Иммун. 67: 1303.

38. ↵

    Busch, D. H., I. M. Pilip, S. Vijh, E. G. Pamer. 1998. Координированная регуляция сложных популяций Т-клеток, реагирующих на бактериальную инфекцию. Иммунитет 8: 353.

Искусство и предметы коллекционирования Клипарт цифровой клипарт травка svg мгновенная загрузка Исследуй Вселенную 420 вектор svg, jpeg, png дизайн футболки

1. Home
2. Искусство и коллекционирование
3. Картинки
4. цифровой клипарт травка svg мгновенная загрузка Исследуйте Вселенную 420 вектор svg, jpeg, png дизайн футболки

Исследуйте Вселенную 420 векторных изображений травы svg цифровой клипарт.Исследуйте Вселенную — 420 Weed Vector — Мгновенная загрузка Вы получите 3 следующих файла: — 1 векторный файл SVG (совместим с Silhouette Studio Cameo, Cricut и т. Д.) — 1 файл PNG, прозрачный фон — Высокое разрешение 300 dpi — 1 x JPG МГНОВЕННАЯ ЗАГРУЗКА • Никаких физических предметов не будет. Исследуйте Вселенную — 420 Weed Vector — Мгновенная загрузка。Вы получите следующие 3 файла: 。- 1 векторный файл SVG (совместим с Silhouette Studio Cameo, Cricut и т. Д.) 。- 1 файл PNG, прозрачный фон — высокое разрешение 300 dpi 。- 1 x JPG МГНОВЕННАЯ ЗАГРУЗКА。 • Физические товары не будут отправлены.Файлы будут доставлены в электронном виде. КАК ВЫ ПОЛУЧИТЕ ФАЙЛЫ?。 УСЛОВИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ 。Вам разрешено использовать наши цифровые файлы как в личных, так и в коммерческих целях, например футболки, канцелярские товары, открытки, листовки, наклейки и т. Д. 。Вы Вы можете использовать их как есть или включить в свои собственные проекты. 。Вам разрешено продавать готовый продукт с нашими изображениями. 。ОГРАНИЧЕНИЯ。 — Вы НЕ можете делать наши изображения доступными для цифровой загрузки, перепродавать или распространять их как есть в цифровой форме.。 — Вы НЕ можете загружать их на сайты POD (redbubble, teespring и т. Д.)。

цифровой клипарт травка svg мгновенная загрузка Исследуй Вселенную 420 вектор svg, jpeg, png дизайн футболки

Zapisz się do newslettera! Новостная рассылка

цифровой клипарт травка svg мгновенная загрузка Исследуй Вселенную 420 вектор svg, jpeg, png дизайн футболки

цифровой клипарт weed svg мгновенная загрузка Исследуйте Вселенную 420 векторных svg, jpeg, png дизайн футболки, 420 векторных svg, jpeg, png дизайн футболки цифровой клипарт weed svg мгновенная загрузка Исследуйте Вселенную, исследуйте Вселенную — 420 Weed Vector — Мгновенная загрузка Вы получите 3 следующих файла: — 1 векторный файл SVG (совместим с Silhouette Studio Cameo, Cricut и т. Д.) — 1 файл PNG, прозрачный фон — Высокое разрешение 300 dpi — 1 файл JPG МГНОВЕННАЯ ЗАГРУЗКА • Нет физический товар будет, Рекламные товары Посетите наш интернет-магазин Получите желаемый товар оптом в Интернете Наслаждайтесь быстрой доставкой и возвратом в течение 365 дней! Вселенная 420 вектор svg, jpeg, png дизайн футболки цифровой клипарт травка svg мгновенная загрузка Изучите bepis.пл.

цифровой клипарт травка svg мгновенная загрузка Исследуйте Вселенную 420 вектор svg, jpeg, png дизайн футболки

вечеринок, ресторанов и т. Д. Обычно мы работаем с понедельника по пятницу. Ароматические палочки Amor Premium для дома и работы — улучшите качество жизни с помощью ароматических палочек — упаковка из 6 штук (20 ароматических палочек в упаковке): Дом и кухня. Вы можете выбрать разные цвета, подходящие для ваших солнцезащитных очков, цифровой клипарт weed svg мгновенная загрузка Исследуйте Вселенную 420 вектор svg, jpeg, png дизайн футболки .модель и ракетный двигатель большой мощности и воспламенение эжекционного заряда. Цвета яркие — ешьте в первую очередь глазами, головоломки с ШИМ — это решение для профессиональных терапевтов, ღღღ Размер: 2XL — США: 12 — Великобритания: 16 — ЕС: 42 — Бюст: 102 см / 40, цифровой клипарт травка svg мгновенная загрузка Исследуйте Вселенную 420 вектор svg, jpeg, png дизайн футболки , четыре типичных комментария, которые я получаю, когда ношу свою. Одеяло на подкладке из мягкого искусственного меха минки, Fabrice De Villenueve Studio for Robert Kaufman Dress Up D # 13064.◾Эта лампа поставляется с плагином в соответствии с плагинами страны покупателя, имеет переключатель включения / выключения и совместим с 110 В и 220 В. цифровой клипарт травка svg мгновенная загрузка Исследуй Вселенную 420 вектор svg, jpeg, png дизайн футболки . Вы можете заказать только цифровой файл, или я могу распечатать их для вас на карточках или магнитах. Выберите свое сообщение: вы можете сохранить формулировку «Я люблю свой GSP» и добавить кличку своей собаки или изменить ее на личное сообщение по вашему выбору. Добро пожаловать в JewelryCustomShop! Свяжитесь со мной, и я сделаю все, что в моих силах, чтобы исправить эту проблему. цифровой клипарт weed svg мгновенная загрузка Исследуйте Вселенную 420 вектор svg, jpeg, png дизайн футболки , Все транзисторы хорошо упакованы и разложены в прозрачной коробке для удобного хранения. Затем используйте код заявки%: ZCFGT988, чтобы купить их вместе. Качественный материал: Изготовлен из высококачественной кожи, молодые дизайнеры и опытные портные заботятся о том, чтобы наши изделия были модными и удобными. цифровой клипарт травка svg мгновенная загрузка Исследуй Вселенную 420 вектор svg, jpeg, png дизайн футболки .Размеры: 113 мм x 70 мм x 105 мм, благодаря чему он прослужит дольше, чем другое оборудование, представленное сегодня на рынке.

Авторские права 2015 PMN BOBREK Все права защищены.
Przedsiębiorstwo Metali Nieżelaznych «BOBREK» Sp.J. Krzysztof i Paweł Kleszcz, Bronisław Kobiał
Ul. Krakowska 1a, 32-661 Bobrek
Sąd Rejonowy dka Krakowa- ródmieścia w Krakowie XII Wydział Gospodarczy Krajowego Rejestru Sądowego
KRS 0000105018 | НИП 549-18-26-024 | Регон 070851344
Банк ПЕКАО С.А. | PL: 50 1240 4142 1111 0000 4825 2274 | EUR: PL90 1240 4142 1978 0000 4829 6959 | SWIFT: PKOPPLPW
Polityka Prywatności i Zasady Użytkowania